一、实验原理与方法概述
HRP标记抗体常用的两种方法为：
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过碘酸钠法（简易法）：利用过碘酸钠将HRP分子中的糖基氧化为醛基，再与抗体氨基结合，形成Schiff碱结构。
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戊二醛两步法：先将HRP与戊二醛反应，形成HRP-戊二醛复合物，再与抗体反应，形成HRP-抗体复合物。
本规范主要介绍过碘酸钠法的操作步骤。
二、实验材料与试剂
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HRP（辣根过氧化物酶）：≥4 mg，纯度高（RZ值≥3）。
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抗体：IgG类抗体，浓度≥2 mg/mL。
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过碘酸钠（NaIO₄）：0.06 mol/L，现配现用。
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乙二醇：0.16 mol/L，终止氧化反应。
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氢化硼钠（NaBH₄）：4 mg/mL，稳定Schiff碱结构。
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PBS缓冲液：0.15 mol/L，pH 7.4，用于透析。
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甘油：60%，用于保存。
Sephadex G-25层析柱：用于去除未反应试剂。
三、操作步骤
1. HRP的醛化处理
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称取5 mg HRP，溶解于1 mL去离子水中。
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加入0.2 mL新配制的0.06 mol/L NaIO₄溶液，室温避光搅拌30分钟，溶液呈黄绿色。
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加入1 mL0.16 mol/L乙二醇溶液，继续室温搅拌1小时，终止氧化反应。
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将反应液装入透析袋中，对1×PBS（pH 7.4）透析过夜，换液3次。
2. HRP-抗体偶联反应
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将透析后的醛化HRP溶液与5 mg抗体溶解于1 mL0.01 mol/L碳酸盐缓冲液中，室温避光搅拌2小时。
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加入0.1 mL新配制的4 mg/mL NaBH₄溶液，混匀，4℃放置2小时，稳定Schiff碱结构。
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将反应液装入透析袋中，对0.15 mol/L PBS（pH 7.4）透析过夜，换液3次。
3. HRP-抗体纯化与保存
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透析后，使用Sephadex G-25层析柱去除未反应试剂。
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收集纯化后的HRP-抗体溶液，加入等体积60%甘油，分装于小瓶中。
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分装后的溶液可在-20℃保存，以防止反复冻融。
四、质量控制与鉴定
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酶活性测定：使用DAB-H₂O₂显色反应法检测HRP活性。
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抗体活性测定：通过ELISA法或免疫扩散法检测抗体活性。
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克分子比值（E/P）测定：使用分光光度计测定OD280和OD403，计算E/P比值。
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标记效率：E/P比值一般为1-2，标记效率应在0.3-0.6之间。
五、注意事项
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所有操作应在避光条件下进行，防止HRP活性丧失。
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使用新鲜配制的试剂，避免试剂降解影响实验结果。
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透析过程中应注意更换缓冲液，确保去除未反应试剂。
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保存HRP-抗体溶液时，应避免反复冻融，以保持其活性。
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