实验简介

本实验用于检测以辣根过氧化物酶（Horseradish Peroxidase, HRP）标记的细胞，采用显色底物体系对目标抗体或蛋白进行定位显示。

实验材料

试剂

• HRP标记抗体孵育好的细胞
• 3% H₂O₂（过氧化氢）
• Diaminobenzidine (DAB) 四盐酸盐
• 0.05 M Tris缓冲液 (pH 7.6)
• 0.3% (w/v) Nickel chloride 或 Cobalt chloride 溶液
• Chloronaphthol 和 绝对乙醇
• Aminoethylcarbazole (AEC) 和 N,N-二甲基甲酰胺（DMF）
• 0.1 M Sodium acetate buffer (pH 5.2)

耗材与器材

• Whatman No. 1 滤纸
• 载玻片、盖玻片
• DPX封片剂或Gelvatol、Mowiol

操作方法

1️⃣ DAB 显色法

1. 将 6 mg DAB 溶解于 10 mL 0.05 M Tris缓冲液 (pH 7.6)
2. 加入 0.1 mL 3% H2O2
3. 若有沉淀，过滤
4. 将工作液加至细胞标本上，室温孵育 1–20 分钟
5. 用蒸馏水终止反应
6. 可选：复染，封片

2️⃣ DAB + 金属盐增强显色法

1. 将 6 mg DAB 溶于 9 mL Tris缓冲液
2. 加入 1 mL 0.3% Nickel chloride 或 Cobalt chloride
3. 再加入 0.1 mL 3% H2O2
4. 若有沉淀，过滤
5. 加至细胞标本，室温孵育 1–20 分钟
6. 用蒸馏水终止反应
7. 可选：复染，封片

3️⃣ Chloronaphthol 显色法

1. 将 0.3 g Chloronaphthol 溶于 10 mL 绝对乙醇，低温保存
2. 取 100 μL 储备液于 10 mL Tris缓冲液 中
3. 加入 0.1 mL 3% H2O2
4. 过滤去除沉淀
5. 将显色液加入细胞，室温孵育 10–40 分钟
6. 用蒸馏水终止反应
7. 可选：复染，封片

4️⃣ AEC 显色法

1. 将 1.0 mL 0.4% AEC 溶液加入 15 mL 0.1 M Sodium acetate buffer (pH 5.2)
2. 加入 0.15 mL 3% H2O2
3. 过滤
4. 显色液加至细胞，室温孵育 10–40 分钟
5. 用蒸馏水终止反应
6. 可选：复染，封片

注意事项

• DAB及AEC需避光操作，AEC产物易褪色，操作需避免气泡
• 所有含H₂O₂溶液现配现用，使用30%母液稀释
• 复染建议参照 Rodig 2019《Counterstaining, Mounting, and Photographing Stained Cells》
• 注意配制液体pH值及溶液保质期

参考文献

Rodig SJ. 2019. Counterstaining, Mounting, and Photographing Stained Cells. Cold Spring Harb Protoc doi:10.1101/pdb.prot099770IF: NA NA NA