【产品组成】

Reagents Volume StorageAnnexin V-FITC 500 ul 4℃避光

Propidium Iodide, PI 1000 ul 4℃避光

Binding Buffer ( 4× ) 20 ml 4℃

【使用方法】

1. 细胞样品准备：

a) 悬浮细胞：

1）收集细胞⾄离⼼管中 1000-2000 rpm 离⼼ 5 min，⼩⼼去除上清。

2）⽤ 1 ml 4℃ 预冷 PBS 轻轻重悬细胞并计数，1000-2000 rpm 离⼼ 5 min，⼩⼼吸除上清。

3）再加⼊ 1 ml 4℃ 预冷的 PBS 重悬细胞，1000-2000 rpm 离⼼ 5 min，⼩⼼吸除上清。

b) 贴壁细胞：

1）吸出细胞培养液⾄离⼼管中，PBS 洗涤贴壁细胞⼀次，加⼊适量不含 EDTA 的胰酶细胞消化液消化细胞。

2）室温孵育⾄轻轻吹打可以使贴壁细胞吹打下来时，吸除胰酶细胞消化液。需避免胰酶的过度消化。

3）加⼊以上步骤中收集的细胞培养液，稍混匀，转移到离⼼管内，1000-2000 rpm 离⼼5 min，⼩⼼吸除上清。注：加⼊的细胞培养液⼀⽅⾯可以收集已经悬浮的发⽣凋亡或坏死的细胞，另⼀⽅⾯细胞培养液中的⾎清可以有效抑制或中和残留的胰酶；残留的胰酶会消化并降解后续加⼊的 Annexin V-FITC导致染⾊失败。

4）⽤ 1 ml 4℃ 预冷 PBS 轻轻重悬细胞并计数，1000-2000 rpm 离⼼ 5 min，⼩⼼吸除上清。

5）再加⼊ 1 ml 4℃ 预冷的 PBS 重悬细胞，1000-2000 rpm 离⼼ 5 min，⼩⼼吸除上清。

2. ⽤去离⼦⽔按 1：4 稀释 Binding Buffer（4ml Binding Buffer + 12ml 去离⼦⽔）；

3. 用 250 µl 结合缓冲液重新悬浮细胞，调节其浓度为 1×106/ ml；

4. 取 100 µl 的细胞悬液于 5 ml 流式管中，加入 5µl Annexin V-FITC，轻轻混匀；

5. 室温 (20-25℃) 避光孵育 10 min；

6. 上机前 5 min 加⼊ 10 µl 碘化丙啶溶液，轻轻混匀；

7. 上机前在反应管中补加 400 µl PBS 重悬细胞，避光保存，随即进⾏流式细胞仪（FACS）检测，Annexin V-FITC 为绿⾊荧光，PI 为红⾊荧光。