目录号：PE101

试剂盒组成、储存、稳定性：

本试剂盒在室温储存12个月不影响使用效果。

特别提醒：

试剂盒使用时请提前准备无水乙醇和异丙醇。

储存事项：

1、第一次使用时，将试剂盒所带的全部RNase A加入溶液A后，置于2-8℃保存。如果溶液A中RNase A失活，提取的质粒可能会有微量RNA残留，在溶液A中补加RNase A即可。

2、环境温度低时溶液B和溶液C中可能会析出浑浊或者沉淀，可在37℃水浴加热几分钟，即可恢复澄清，不要剧烈摇晃，以免形成过量的泡沫。

3、避免试剂长时间暴露于空气中产生挥发、氧化、pH值变化，各溶液使用后应及时盖紧盖子。

产品介绍：

本试剂盒采用改进SDS-碱裂解法裂解细胞，离心吸附柱内的硅基质膜在高盐、低pH值状态下选择性地结合溶液中的质粒DNA，再通过去蛋白液和漂洗液将杂质和其它细菌成分去除，最后低盐、高pH值的洗脱缓冲液将纯净质粒DNA从硅基质膜上洗脱。

产品特点：

1、离心吸附柱内硅基质膜全部采用世界著名公司特制吸附膜，柱与柱之间吸附量差异极小，可重复性好。

2、快速、方便，不需要使用有毒的苯酚、氯仿等试剂，也不需要乙醇沉淀。获得的质粒产量高、纯度好， 可以直接用于酶切、转化、PCR、体外转录、测序等各种分子生物学实验。

注意事项：

1、本试剂盒适用菌株为XL-1 Blue、Top10和DH5α等核酸酶含量低缺陷型菌株。所用菌株为JM系列、HB101等endA菌株或野生型菌株，核酸酶含量丰富，应购买本公司生产的高纯度质粒小量快速提取试剂盒（PE102）。

2、所有的离心步骤均在室温完成，使用转速可以达到13,000rpm的传统台式离心机。

3、溶液C中含有刺激性化合物，操作时要戴乳胶手套，避免沾染皮肤、眼睛和衣服。若沾染皮肤、眼睛时，要用大量清水或者生理盐水冲洗。

4、提取质粒的量与细菌培养浓度、质粒拷贝数等因素有关。一般高拷贝质粒，建议接种单菌落于1.5-4.5 ml加合适抗生素的LB培养基， 过夜培养14-16个小时，可提取出多达20µg的纯净质粒。如果所提质粒为低拷贝质粒或大于10kb的大质粒，应适当加大菌体使用量，使用5-10 ml过夜培养物，同时按比例增加A、B、C的用量，其它步骤相同。

5、得到的质粒DNA可用琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测浓度与纯度。OD260值为1相当于大约50μg/ml DNA。电泳可能为单一条带，也可能为2条或者多条DNA条带，这主要是不同程度的超螺旋构象质粒泳动位置不一造成，与提取物培养时间长短、提取时操作剧烈程度等有关。本公司产品正常操作情况下基本超螺旋可以超过90%。

6、质粒DNA确切分子大小， 必须酶切线性化后，对比DNA分子量Marker才可以知道。处于环状或者超螺旋状态的的质粒，泳动位置不确定，无法通过电泳知道其确切大小。

7、洗脱液EB不含有螯合剂EDTA，不影响下游酶切、连接等反应。也可以使用水洗脱，但应该确保pH大于7.5，pH过低影响洗脱效率。用水洗脱质粒应该保存在－20℃。质粒DNA如果需要长期保存，可以用TE缓冲液洗脱（10mM Tris-HCl， 1mM EDTA，pH 8.0），但是EDTA可能影响下游酶切反应，使用时可以适当稀释。

操作步骤：（实验前请先阅读注意事项）

提示：

     ● 第一次使用前请先在漂洗液WB瓶中加入指定量无水乙醇，充分混匀，加入后请及时在方框打钩标记，以免多次加入!

     ● 第一次使用前请先在漂洗液BS瓶中加入指定量异丙醇，充分混匀，加入后请及时在方框打钩标记，以免多次加入!

     ● 将RNase A全部加入溶液A中，混匀，每次使用后置于2-8℃保存。

1、将带有质粒的E.coli接种于5 mL LB/抗生素培养液中，37℃搖床培养12~16 h。

2、取1.0~5.0 mL的菌液，室温下10,000rpm离心1 min，尽可能的倒干上清，收集菌体。

收集超过1.5 ml菌液，可以离心弃上清后，在同一个1.5 ml管内加入更多的菌液，重复步骤，直到收集到足够的菌体。

3、加入250 µl溶液A/RNaseA混合液，漩涡振荡使菌体完全悬浮。

如果有未彻底混匀的菌块，会影响裂解，导致提取量和纯度偏低。

4、往重悬混合液中加入250 µl溶液B，轻轻颠倒混匀6-8次使菌体充分裂解。

温和地混合，不要剧烈震荡，以免基因组DNA剪切断裂！所用时间不应超过5分钟！以免质粒受到破坏。此时菌液应变得清亮粘稠，如果菌体少，很快清亮粘稠后就可以做下一步，不是一定要准确的5分钟。

5、加入350 μl溶液C，立即轻轻颠倒混匀6-8，充分混匀至出现白色絮状沉淀。13,000rpm离心10分钟，小心取上清。

加入溶液C后应该立即混匀，以免产生SDS的局部沉淀。

6、将上一步所得上清加入吸附柱AD中（吸附柱AD放入收集管CT中）， 13,000rpm离心1分钟，倒掉收集管CT中的废液。

7、把柱子重新装回收集管，加入500 µl平衡液BS（请先检查是否已加入异丙醇!），室温下13,000rpm离心1分钟，弃去废液。

8、加入700 μl漂洗液WB（请先检查是否已加入无水乙醇!），13,000rpm 离心1分钟，弃掉废液。

9、加入700 μl漂洗液WB，13,000rpm 离心1分钟，弃掉废液。

10、将吸附柱AD放回空收集管CT中，13,000rpm离心2分钟，尽量除去漂洗液， 以免漂洗液中残留乙醇抑制下游反应。

11、取出吸附柱AD，放入一个干净的离心管中，在吸附膜的中间部位加30-100 μl洗脱缓冲液EB（洗脱缓冲液使用前在 65-70℃水浴中加热效果更好），室温放置2分钟，13,000rpm 离心1分钟。如果需要较多量质粒，可将得到的溶液重新加入离心吸附柱中，离心1分钟。

洗脱体积越大，洗脱效率越高。如果需要质粒浓度较高，可以适当减少洗脱体积， 但是最小体积不应少于30 μl，体积过小降低质粒洗脱效率，减少质粒产量。

12、将洗脱的DNA保存在-20℃。