目录号：PE103

试剂盒组成、储存、稳定性：

本试剂盒在室温储存12个月不影响使用效果。

内毒素清除剂ER常温运输，4度可以保存一个月，长期保存放-20℃。

储存事项:

1、第一次使用时，将试剂盒所带的全部RNase A加入溶液A后（终浓度100ug/ml）置于2-8℃保存。如果溶液A中RNase A失活，提取的质粒可能会有微量RNA残留，在溶液A中补加RNase A即可。

2、环境温度低时溶液B中SDS可能会析出浑浊或者沉淀，可在37℃水浴加热几分钟，即可恢复澄清，不要剧烈摇晃，以免形成过量的泡沫。

3、避免试剂长时间暴露于空气中产生挥发、氧化、pH值变化，各溶液使用后应及时盖紧盖子。

产品介绍：

本试剂盒采用改进SDS-碱裂解法裂解细胞，通过独特的内毒素清除剂ER选择性结合离心除去内毒素，然后离心吸附柱内的硅基质膜在高盐、低pH值状态下选择性地结合溶液中的质粒DNA，再通过去蛋白液和漂洗液将杂质和其它细菌成分去除，最后低盐、高pH值的洗脱缓冲液将纯净质粒DNA从硅基质膜上洗脱。

产品特点：

1、离心吸附柱内硅基质膜全部采用世界著名公司特制吸附膜，柱与柱之间吸附量差异极小，可重复性好。

2、独特工艺配方清除内毒素，内毒素含量极低（<0.1 EU/μg DNA），细胞转染效果极佳。也可直接用于酶切、转化、PCR、体外转录、测序、等各种分子生物学实验。

注意事项

1、所有的离心步骤均在室温完成，使用转速可以达到13,000rpm的传统台式离心机。

2、提取质粒的量与细菌培养浓度、质粒拷贝数等因素有关。一般高拷贝质粒，建议接种单菌落于1.5-4.5 ml加合适抗生素的LB培养基， 过夜培养14-16个小时，可提取出多达20µg的纯净质粒。如果所提质粒为低拷贝质粒或大于10kb的大质粒，应适当加大菌体使用量，使用5-10 ml过夜培养物，同时按比例增加A、B、D的用量，其它步骤相同。

3、得到的质粒DNA可用琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测浓度与纯度。OD260值为1相当于大约50μg/ml DNA。电泳可能为单一条带，也可能为2条或者多条DNA条带，这主要是不同程度的超螺旋构象质粒泳动位置不一造成，与提取物培养时间长短、提取时操作剧烈程度等有关。本公司产品正常操作情况下基本超螺旋可以超过90%。

4、质粒DNA确切分子大小， 必须酶切线性化后，对比DNA分子量Marker才可以知道。处于环状或者超螺旋状态的的质粒，泳动位置不确定，无法通过电泳知道其确切大小。

5、洗脱液EB不含有螯合剂EDTA，不影响下游酶切、连接等反应。也可以使用水洗脱，但应该确保pH大于7.5，pH过低影响洗脱效率。用水洗脱质粒应该保存在－20℃。质粒DNA如果需要长期保存，可以用TE缓冲液洗脱（10mM Tris-HCl， 1mM EDTA，pH 8.0），但是EDTA可能影响下游酶切反应，使用时可以适当稀释。

关于平衡液BS的使用

介绍：核酸吸附硅胶膜柱子长期放置过程中会同空气中的电荷/尘埃发生反应而影响其核酸的结合能力。硅胶柱经平衡液BS预处理后可大大减少柱子中硅胶膜的憎水基团，提高核酸的结合能力。从而提高硅胶柱子回收效率或者产量。平衡液BS是强碱性溶液，若不小心碰到，请用大量自来水清洗。用完后需盖紧瓶盖，以免接触空气。室温保存。在保存过程中可能有沉淀生成，请加热至37℃使沉淀完全消失。

使用方法：取一个新的硅胶膜吸附柱装在收集管CT中，吸取100μl的平衡液BS至柱子中。13000 rpm离心1分钟，倒掉收集管CT中废液，将吸附柱子重新放回收集管CT。此时平衡液BS预处理柱子完毕。接后续的操作步骤。

操作步骤：（实验前请先阅读注意事项）

提示：

     ● 第一次使用前请先在漂洗液WB瓶中加入指定量无水乙醇，充分混匀，加入后请及时在方框打钩标记已加入乙醇，以免多次加入!

     ● 将RNase A全部加入溶液A中，混匀，每次使用后置于2-8℃保存。

1、取1.5-4.5 ml过夜培养的菌液，12,000rpm离心30秒，尽可能的倒干上清，收集菌体。

收集超过1.5 ml菌液， 可以离心弃上清后，在同一个1.5ml管内加入更多的菌液，重复步骤1，直到收集到足够的菌体。

2、用250μl溶液A重悬菌体沉淀，涡旋振荡至彻底悬浮。  

如果有未彻底混匀的菌块，会影响裂解，导致提取量和纯度偏低。

3、加250μl的溶液B，温和地上下翻转6 -8次使菌体充分裂解，室温放置4分钟。

温和地混合，不要剧烈震荡，以免基因组DNA剪切断裂！所用时间不应超过5分钟！以免质粒受到破坏。此时菌液应变得清亮粘稠，如果菌体少，很快清亮粘稠后就可以做下一步，不是一定要准确的5分钟。

4、加250μl溶液D，立即温和地上下翻转6 -8次，充分混匀时会出现白色絮状沉淀。13,000rpm离心10分钟，小心取上清至新管，避免吸取到漂浮白色沉淀。

加入溶液D后应该立即混匀，以免产生SDS的局部沉淀。

5、加入0.1体积(上清的体积的10%，约80µl)的内毒素清除剂ER到上一步所得上清，颠倒旋转混匀，冰浴或者插入碎冰中(或冰箱冷冻室)放置5分钟直到浑浊变清亮透明（或仍旧稍有浑浊），中间偶尔混匀几次。

内毒素清除剂ER加入上清后，上清会变得浑浊，但是冰浴后应恢复清亮（或稍浑浊）。

6、常温放置3-5分钟，温度恢复室温溶液很快变为浑浊，颠倒混匀。

如室内温度较低或者想加快速度可以在37-42℃水浴，将很快变浑浊，颠倒混匀。

7、室温14,000 x g离心10 分钟分相 。上层水相含DNA，下层蓝色油状相含内毒素和其它杂质。将含DNA的上层水相转移到新管（注意不要吸到蓝色油状层，里面含内毒素等杂质），弃油状层。

平衡液BS预处理吸附柱：

使用平衡液BS预处理硅胶膜吸附柱为必做步骤，具体方法参见前文“关于平衡液BS的使用”

8、向上层水相中加入0.5体积异丙醇（约370µl）后充分颠倒混匀后分两次（每次不超过700µl）转入吸附柱AD中（吸附柱AD放入收集管CT中），12,000 x g离心1分钟，倒掉收集管CT中的废液。直到所有混合溶液通过此吸附柱。

9、加入600μl漂洗液WB（请先检查是否已加入无水乙醇!），12,000rpm 离心30秒，弃掉废液。再加入600μl漂洗液WB，重复漂洗一次。

10、将吸附柱AD放回空收集管CT中，13,000rpm离心2分钟，尽量除去漂洗液， 以免漂洗液中残留乙醇抑制下游反应。

11、取出吸附柱AD，放入一个干净的离心管中，在吸附膜的中间部位加50-100μl洗脱缓冲液EB（洗脱缓冲液事先在 65-70℃水浴中加热效果更好），室温放置2分钟，12,000rpm 离心1分钟。如果需要较多量质粒，可将得到的溶液重新加入离心吸附柱中，室温放置2分钟，离心1分钟。

洗脱体积越大，洗脱效率越高。如果需要质粒浓度较高，可以适当减少洗脱体积， 但是最小体积不应少于30μl，体积过小降低质粒洗脱效率，减少质粒产量。