1/适用范围：

适用于快速提取各种全血/血清/血浆/液体样本miRNA和总RNA。

2/试剂盒组成、储存、稳定性：

本试剂盒按照指示储存6个月不影响使用效果。

3/储存事项

1、漂洗液A和漂洗液B加入无水乙醇后，可以在常温保存。

2、漂洗液B可能加入乙醇使用几天后出现沉淀晶体，并不影响使用，直接不吸晶体，吸上清使用就可以。

3、运输在常温下进行，不影响使用效果。

4、避免试剂长时间暴露于空气中产生挥发、氧化、PH值变化，各溶液使用后应及时盖紧盖子。

4/产品介绍：

近年来对RNA干扰和调节性小RNA的广泛研究迫切需要一种能有效提取15-30核苷酸左右大小RNA（包括siRNA和miRNA）的试剂盒。但是传统的RNA提取方法如硅胶膜不能有效吸附回收，酚/胍抽提和乙醇沉淀并不能有效沉淀回收微小分子RNA，对于血液样本更是由于其自身特点更难提取。本试剂盒采用独特的裂解液迅速直接裂解全血（液体样本）和灭活细胞RNA酶，强烈有机抽提去除蛋白和DNA，RNA包括微小分子RNA吸附于离心柱内特殊硅基质膜， 再通过一系列快速的漂洗－离心的步骤,漂洗液将细胞代谢物，蛋白等杂质进一步去除， 最后低盐的洗脱液将纯净RNA从硅基质膜上洗脱。

5/产品特点：

1、离心吸附柱内硅基质膜全部采用世界著名公司特制吸附膜，柱与柱之间吸附量差异极小，可重复性好。

2、不需要乙醇沉淀等容易丧失微小分子RNA的步骤。

3、独有的裂解液配方，可直接裂解全血，不需要先裂解去除红细胞。

4、多次柱漂洗确保高纯度，OD260/OD280典型的比值达1.9～2.0，基本无DNA残留。可用于RNAi，RT-PCR，Northern-blot和各种实验。

6/注意事项：

1、第一次使用前请先在70%乙醇、漂洗液A瓶和漂洗液B瓶中加入指定量乙醇，加入后请及时打钩标记已加入乙醇，以免多次加入!

2、所有的离心步骤均在室温完成，使用转速可以达到13,000 rpm的传统台式离心机。

3、需要自备乙醇，氯仿。

4、Lysis buffer和漂洗液A含有刺激性化合物，操作时要戴乳胶手套，避免沾染皮肤，眼睛和衣服。若沾染皮肤、眼睛时，要用大量清水或者生理盐水冲洗

5、预防RNase 污染，应注意以下几方面：

1. ① 经常更换新手套。因为皮肤经常带有细菌，可能导致RNase 污染。
2. ② 使用无RNase 的塑料制品和枪头避免交叉污染。
3. ③ RNA 在裂解液中时不会被RNase 降解。但提取后继续处理过程中应使用不含RNase 的塑料和玻璃器皿。玻璃器皿可在150℃烘烤4小时，塑料器皿可在0.5 M NaOH 中浸泡10 分钟，然后用水彻底清洗，再灭菌，即可去除RNase。
4. ④ 配制溶液应使用无RNase 的水。（将水加入到干净的玻璃瓶中，加入DEPC至终浓度0.1%( v/v)，37℃放置过夜，高压灭菌。）

5、RNA 纯度及浓度检测：

完整性：RNA 可用普通琼脂糖凝胶电泳 (电泳条件：胶浓度1.2%；0.5×TBE电泳缓冲液；150v，15分钟)检测完整性。由于细胞中70%-80%的RNA 为rRNA，电泳后UV 下应能看到非常明显的rRNA 条带。动物rRNA 大小分别约为5 kb 和2kb，分别相当于28S和18S rRNA。动物RNA 样品中最大rRNA 亮度应为次大rRNA亮度的1.5-2.0 倍，否则表示RNA 样品的降解。出现弥散片状或条带消失表明样品严重降解。

纯度：OD260/OD280比值是衡量蛋白质污染程度的指标。高质量的RNA，OD260/OD280读数（10mMTris, pH7.5）在1.8-2.1 之间。OD260/OD280读数受测定所用溶液的pH 值影响。同一个RNA 样品，假定在10mM Tris，pH7.5 溶液中测出的OD260/OD280 读数1.8-2.1 之间，在水溶液中所测读数则可能在1.5-1.9 之间，但这并不表示RNA 不纯。

浓度：取一定量的 RNA 提取物，用RNase-free 水稀释n 倍，用RNase-free水将分光光度计调零，取稀释液进行OD260，OD280测定，按照以下公式进行RNA浓度的计算：终浓度（ng/μl）= (OD260)×(稀释倍数n)×40。

7/操作步骤：（实验前请先阅读注意事项）

提示：第一次使用前请先在70%乙醇、漂洗液A瓶和漂洗液B瓶中加入指定量乙醇！

1、每0.25ml液体样品(血清，血浆，脑脊液等等)加入0.75ml Lysis buffer，用加样枪吹打液体样品几次以帮助裂解样品中细胞。每5~10×106个细胞至少加入0.75ml Lysis buffer。对于含有高污染物样品如全血样品，可以用灭菌水按照1：1比例稀释一倍后开始提取。Lysis buffer和液体样品的终体积比总是3：1。

2、将样品剧烈震荡混匀，在15 -30°C条件下孵育5分钟以使核蛋白体完全分解。

3、每0.75ml Lysis buffer加0.2 ml氯仿，剧烈振荡15秒并室温下放置2分钟。

4、于4℃12,000 rpm 离心10分钟，样品会分成三层：下层有机相，中间层和上层无色的水相，RNA存在于水相中。水相层的容量大约为所加Lysis buffer体积的70%。

5、小心取上清（精确计算体积）转入到新的离心管，加入1.5倍体积的无水乙醇（必须是室温的），涡旋混匀。此时可能出现沉淀，但是不影响提取过程，立即吹打混匀，不要离心，立刻接下步。

6、将混合物(每次小于700μl,多可以分两次加入)加入一个吸附柱AC中，（吸附柱AC放入收集管CT中）12,000 rpm离心30-60秒，弃掉废液。

7、加700μl 漂洗液A（请先检查是否已加入无水乙醇!），12,000rpm 离心30秒，弃掉废液。

8、加入500μl 漂洗液B（请先检查是否已加入无水乙醇!），12,000 rpm 离心30秒，弃掉废液。加入500μl 漂洗液B，重复一遍。

9、将吸附柱AC放回空收集管CT中，13,000 rpm离心2分钟，尽量除去漂洗液, 以免漂洗液中残留乙醇抑制下游反应。

10、取出吸附柱AC，放入一个RNase free离心管中，根据预期RNA产量在吸附膜的中间部位加30-50μl RNase free water（事先在 100℃水浴中预热效果更好）， 室温放置1分钟，12,000 rpm 离心1分钟。

11、如果预期RNA产量>30μg,加30-50μl RNase free water重复步骤10, 合并两次洗脱液,或者使用第一次的洗脱液加回到吸附柱重复步骤一遍(如果需要RNA浓度高)。

洗脱两遍的RNA洗脱液浓度高, 分两次洗脱合并洗脱液的RNA产量比前者高1 5–30%, 但是浓度要低,用户根据需要选择。

8/附：microRNA富集方法（仅仅提取microRNA，不包含>200 nt其它总RNA成份。）

1、按照前面标准操作步骤1－5操作，直到得到上清。

2、较精确估计上清体积，加入等体积70％乙醇（请先检查是否已加入无水乙醇!）（必须是室温的），涡旋或者吹打充分混匀，不要离心。

3、将混合物加入一个吸附柱AC中，（吸附柱AC放入收集管CT中）12,000 rpm离心30-60秒，收集滤过物。将滤过物从收集管CT转移到一个新的离心管后，把吸附柱子放回空的收集管CT内，再加入剩下的混合物，离心，收集滤过物。合并两次滤过物，计算体积。此时，滤过物含有microRNA, 吸附柱子上面是除去了microRNA的总RNA（不包含microRNA），如果需要，可以按照前面标准操作步骤7－10操作漂洗，洗脱回收得到去除了microRNA的总RNA。

4、较精确估计滤过物体积，加入0.65倍体积无水乙醇（必须是室温的），涡旋或者吹打充分混匀，不要离心。

5、取一套新的microRNA吸附柱MA， 将上一步骤混合物(每次小于700μl，多可以分两次加入)加入microRNA吸附柱MA中，（吸附柱放入收集管CT中）12,000 rpm离心30秒，弃掉废液。

6、按照前面标准操作步骤7－10操作漂洗，洗脱得到富集的microRNA。

注意：不同的实验可以选择不同的方法，例如Northern Blot或者表达芯片谱分析可以选择提取包括microRNA的总RNA。富集方法提取的microRNA因为去除了较大片段的mRNA和rRNA等，可能减少某些下游试验的扩增背景，当背景较高或者非特异扩增较多时，可以尝试使用富集方法提取的microRNA。