1/适用范围：

适用于快速提取动物（含昆虫）microRNA或者microRNA/总RNA分别提取。

2/试剂盒组成、储存、稳定性：

本试剂盒在室温储存6个月不影响使用效果。

3/储存事项：

1、所有的溶液应该是澄清的，如果环境温度低时溶液可能形成沉淀，此时不应该直接使用，可在37℃水浴加热几分钟，即可恢复澄清。

2、不合适的储存于低温（4℃或者－20℃）会造成溶液沉淀，影响使用效果，因此运输和储存均在室温下（15℃－25℃）进行。

3、漂洗液B可能加入乙醇使用几天后出现沉淀晶体，并不影响使用，直接不吸晶体，吸上清使用就可以。

4、避免试剂长时间暴露于空气中产生挥发、氧化、PH值变化，各溶液使用后应及时盖紧盖子。

4/产品介绍：

传统的microRNA提取试剂盒均是采用异硫氰酸胍/苯酚/氯仿（TRIzol法）加高浓度乙醇硅胶膜吸附小片段microRNA的原理方法制成，但是复杂的样品用TRIzol的原理甚至无法提取符合要求的总RNA，更不用说microRNA。因此很多世界著名公司采用Trizol法原理的microRNA提取试剂盒面临复杂样品时束手无策，产品线中干脆就没有复杂样品microRNA提取试剂盒。用户万般无奈只好用传统方法，或者TRIzol法提取，用异丙醇/乙醇沉淀方法来提取microRNA，虽然也能提取到部分microRNA，但是沉淀法损失巨大或者和杂质共沉淀，影响实验结果，投稿时常常面临质疑。而本试剂盒在创新性的不用苯酚、氯仿的技术路线下解决该问题。

独特的裂解液迅速裂解细胞和灭活细胞RNA酶，RNA助提剂PLA帮助结合多糖多酚并通过离心去除，然后裂解混合物通过基因组DNA清除柱CC，基因组DNA被清除而RNA（包括microRNA）被选择性滤过。滤过的RNA用乙醇调节结合条件后，RNA在高离序盐状态下选择性吸附于离心柱内硅基质膜，再通过一系列特殊漂洗液快速的漂洗－离心的步骤,将细胞代谢物，蛋白等杂质去除，最后低盐的RNase free H20将纯净RNA（包括microRNA）从硅基质膜上洗脱。

采用分提取操作步骤也可单独纯化富集后的microRNA组分和总RNA（>200 nt）从而得到分离富集的microRNA和RNA。

5/产品特点：

1、完全不使用有毒的苯酚，氯仿等试剂，也不需要乙醇沉淀等步骤。

2、快速，简捷，单个样品操作一般可在30分钟内完成。

3、独有的RNA助提剂可以有效提高清除效果。

4、多次柱漂洗确保高纯度，OD260/OD280典型的比值达2.0～2.2，可用于RT-PCR，Northern-blot和各种实验。

6/注意事项

1、所有的离心步骤均可在室温完成（或4℃离心也可以），使用转速可以达到13,000 rpm的传统台式离心机。

2、需要自备乙醇，β-巯基乙醇，研钵(可选)。

3、样品处理量绝对不要超过基因组清除柱CC和和RNA吸附柱AC处理能力，否则造成DNA残留或产量降低。开始摸索实验条件时，如果不清楚样品DNA/RNA含量时可使用较少的样品处理量，将来根据样品试验情况增加或者减少处理量。

4、裂解液LBT Plus和漂洗液A中含有刺激性化合物，操作时戴乳胶手套，避免沾染皮肤，眼睛和衣服。若沾染皮肤、眼睛时，要用大量清水或者生理盐水冲洗。 

5、关于DNA 的微量残留：

一般说来任何总RNA提取试剂在提取过程中无法完全避免DNA的微量残留（DNase消化也无法做到100%无残留），该产品由于采取了本公司独特的缓冲体系和基因组DNA清除柱技术，绝大多数DNA已经被清除，个别特殊情况需要清除微量基因组DNA残留，可使用以下几种DNA酶消化的方式。

5. ① 传统DNA酶消化提取的RNA/microRNA，热灭活DNA酶后直接用于后续实验。
6. ② 传统DNA酶消化提取的RNA/microRNA，然后使用RNA清洁纯化试剂盒（货号：RE132，但是需要将说明书改动一个地方，第二步加入250μl无水乙醇改成加入700μl无水乙醇)清洁纯化后用于后续实验。
7. ③ 直接在吸附柱AC上进行DNase I柱上消化处理。购买DNA酶柱上消化试剂盒(货号：RE128，但是需将说明书的去蛋白液PRS改成漂洗液A) 可先索取具体操作说明书。

6、碰到特别复杂多糖多酚，淀粉等次级代谢产物特别丰富的样品，如葡萄果实，水稻种子，裂解液LBT Plus效果不佳的情况下，应该购买专用裂解液CLB。裂解液CLB是本公司为特别复杂的样品研发的最强配方，绝大部分裂解液LBT Plus无法提取的复杂样品都可以提取成功。见附录3。

7/操作步骤：（实验前请先阅读注意事项）

提示：

     ● 第一次使用前请先在漂洗液A和漂洗液B瓶加入指定量无水乙醇!

    ● 对于RNA酶或者特殊组织：操作前在裂解液LBT Plus中加入β-巯基乙醇至终浓度1%，如1 ml LBT Plus 中加入10μl β-巯基乙醇。此裂解液最好现用现配。配好的LBT Plus 4℃可放置一个月。

1、直接研磨法（提取简单样品推荐此法，但是简单样品也可以用液氮研磨法）:

a.  新鲜组织称重后取100mg迅速剪成小块放入研钵（冰冻保存或者液氮保存样品可直接称重后取100mg放入研钵）， 加入10体积（1ml）LBT Plus和1体积（100μl） PLA 室温下充分研磨成匀浆，注意应该迅速研磨让组织和裂解液LBT Plus立刻充分接触以抑制RNA酶活性。

注：PLA是提取困难样品不可缺少成分。

b.  将裂解物转入离心管，剧烈摇晃振荡15秒，13，000rpm离心5-10分钟,沉淀不能裂解的碎片和结合有杂质的PLA。

c. 取480μl裂解物上清（在不超过基因组DNA清除柱CC能力的情况下可以取更多的上清，这样可以提高产量，如残留基因组DNA较多，可适当减少取上清量）将裂解物上清加到DNA清除柱CC上（清除柱CC放在收集管CT内）。

d.  立刻接操作步骤的步骤3。

2、液氮研磨法（提取复杂，易降解样品时推荐此法）:

a.  取500μl裂解液LBT Plus，转入1.5ml离心管中，加50μl PLA混匀备用。

b.  液氮中研磨适量组织成细粉后，取50mg细粉转入上述装有LBT Plus和PLA的离心管, 立即用手剧烈振荡20秒，充分裂解。

c.  用吸头吹打混匀帮助裂解或者剧烈涡旋震荡直到得到满意匀浆结果(或者电动匀浆30秒)，可以剪切DNA，降低粘稠度和提高产量。

d.  将裂解物13,000 rpm离心5-10分钟，沉淀不能裂解的碎片和结合有杂质的PLA。

e.  取裂解物上清（在不超过基因组DNA清除柱CC能力的情况下可以取更多的上清，这样可以提高产量）将裂解物上清加到DNA清除柱CC上（清除柱CC放在收集管CT内）。

f.  立刻接操作步骤的步骤3。

注意：以上液氮研磨法用户可以根据需要加倍处理，可以提高产量。也就是使用1ml的裂解液LBT Plus和100μl PLA和100mg的样品。

3、立即13,000 rpm离心60秒，收集滤液（RNA在滤液中）。

4、用微量移液器较精确估计滤过液体积（480μl左右，滤过时候损失体积应该减去），加入1.25倍体积的无水乙醇，此时可能出现沉淀，但是不影响提取过程，立即吹打混匀，不要离心。

5、立刻将混合物(每次小于700μl，多可以分两次加入)加入一个吸附柱AC中，（吸附柱AC放入收集管CT中）13,000 rpm离心30秒，弃掉废液。

确保离心后液体全部滤过去，膜上没有残留，如有必要，可以加大离心力和离心时间。

6、加700μl 漂洗液A（请先检查是否已加入无水乙醇!），12,000rpm 离心30秒，弃掉废液。

7、加入500μl 漂洗液B（请先检查是否已加入无水乙醇!），12,000 rpm 离心30秒，弃掉废液。加入500μl 漂洗液B，重复一遍。

8、将吸附柱AC放回空收集管CT中，13,000 rpm离心2分钟，尽量除去漂洗液, 以免漂洗液中残留乙醇抑制下游反应。

9、取出吸附柱AC，放入一个RNase free离心管中，根据预期RNA产量在吸附膜的中间部位加30-50μl RNase free water， 室温放置1分钟，12,000 rpm 离心1分钟。

将洗脱液加回到吸附柱重复洗脱步骤一遍可以提高产量约10-15%。

10、得到的RNA/microRNA可以立即用于下游反应或者尽快置于低温保存。

8/附录1：microRNA富集方法（microRNA/去除了microRNA的总RNA分别提取）

提示：

    ● 对于RNA酶或者特殊样品组织：操作前在裂解液LBT Plus中加入β-巯基乙醇至终浓度1%，如1 ml LBT Plus 中加入10μl β-巯基乙醇。此裂解液最好现用现配。配好的LBT Plus 4℃可放置一个月。

1、直接研磨法（提取简单样品推荐此法，但是简单样品也可以用液氮研磨法）:

a.  新鲜组织称重后取100mg迅速剪成小块放入研钵（冰冻保存或者液氮保存样品可直接称重后取100mg放入研钵），加入10体积（1ml）LBT Plus和1体积（100μl） PLA 室温下充分研磨成匀浆，注意应该迅速研磨让组织和裂解液RLT立刻充分接触以抑制RNA酶活性。

注：PLA是提取困难样品不可缺少成分。

b.  将裂解物转入离心管，剧烈摇晃振荡15秒，13,000rpm离心5-10分钟,沉淀不能裂解的碎片和结合有多糖多酚的PLA。

c.  取480μl裂解物上清（在不超过基因组DNA清除柱CC能力的情况下可以取更多的上清，这样可以提高产量，如残留基因组DNA较多，可适当减少取上清量）转到一个新离心管。加入上清体积一半的无水乙醇(0.5体积)，此时可能出现沉淀,但是不影响提取过程,立即吹打混匀,不要离心。

d.  立刻接富集方法的步骤3。

2、液氮研磨法（提取复杂，易降解样品时推荐此法）:

a.  取500μl裂解液LBT Plus，转入1.5ml离心管中，加50μl PLA混匀备用。

b.  液氮中研磨适量组织成细粉后，取50mg细粉转入上述装有LBT Plus和PLA的离心管, 立即用手剧烈振荡20秒，充分裂解。

c.  用吸头吹打混匀帮助裂解或者剧烈涡旋震荡直到得到满意匀浆结果(或者电动匀浆30秒)，可以剪切DNA，降低粘稠度和提高产量。

d.  将裂解物13,000 rpm离心5-10分钟，沉淀不能裂解的碎片和结合有杂质的PLA。

e.  取裂解物上清（在不超过基因组DNA清除柱CC能力的情况下可以取更多的上清，这样可以提高产量）转到一个新离心管。加入上清体积一半的无水乙醇(0.5体积)，此时可能出现沉淀,但是不影响提取过程，立即吹打混匀,不要离心。

f.  立刻接富集方法的步骤3。

注意：以上液氮研磨法用户可以根据需要加倍处理，可以提高产量。也就是使用1ml的裂解液LBT Plus和100μl PLA和100mg的样品。

3、将混合物(每次小于720μl，多可以分两次加入)加入一个基因组清除柱CC中，（清除柱CC放入收集管CT中）13,000 rpm离心2分钟，保留滤液（microRNA在滤液中）。

此时，滤过液含有microRNA，基因组DNA清除柱CC上面是去除了microRNA的总RNA（不包含microRNA），如果需要，可以按照前面标准操作步骤6－10操作漂洗，洗脱回收得到去除了microRNA的总RNA。

4、用微量移液器较精确估计滤过液体积，加入0.65倍体积无水乙醇（必须是室温的），涡旋或者吹打充分混匀，不要离心。

5、立刻将混合物(每次小于700μl，多可以分两次加入)加入一个吸附柱AC中，（吸附柱放入收集管CT中）13,000 rpm离心2分钟，弃掉废液。

确保离心后液体全部滤过去，膜上没有残留，如必要，可加大离心力和离心时间。

6、按照前面标准操作步骤6－10操作漂洗，洗脱得到富集的microRNA。

注意：不同的实验可以选择不同的方法，例如Northern Blot或者表达芯片谱分析可以选择提取包括microRNA的总RNA。富集方法提取的microRNA因为去除了较大片段的mRNA和rRNA等，可能减少某些下游试验的扩增背景，当背景较高或者非特异扩增较多时，可以尝试使用富集方法提取的microRNA。 

9/附录2：DNA酶柱上消化（详细请参考DNase I 柱上消化试剂盒说明书)

1、按照前面所列操作步骤操作，直到做完操作步骤5。

2、取45μl DNase I buffer和5μl RNase free DNase I在离心管轻轻吹打混匀成工作液（处理多个离心柱子要按照比例放大制备工作液）。

3、向吸附柱AC 中加入350μl 漂洗液A，12,000 rpm 离心30 秒，弃废液，将吸附柱放回收集管CT中。

4、向吸附柱AC 中央加入50μl的DNase I 工作液，室温（20℃-30℃）放置15分钟。注意直接将工作液滴在膜中央上向膜四周浸润充分和膜接触，不要让工作液滴在O型垫圈或是离心柱管壁上挂壁或者挂在垫圈上不能充分和膜接触。

5、向吸附柱AC 中加入350μl 漂洗液A，12,000 rpm 离心30-60 秒，弃废液，将吸附柱放回收集管CT中。

6、接操作步骤7完成后续步骤。

10/附录3：使用裂解液CLB

提示：

    ● 第一次使用前请先在漂洗液A和漂洗液B瓶加入指定量无水乙醇!

    ● 取1ml裂解液 CLB至离心管内(如果CLB有析出或者沉淀需先置于65°C水浴重新溶解）， 在裂解液CLB中加入5%ß-巯基乙醇（1ml CLB加50μl ß-巯基乙醇）。颠倒混匀后65°C水浴中预热。

1、液氮中研磨新鲜或-70°C冷冻的材料至细粉。

2、转移100-150mg细粉（水分少的样品如种子叶片等可加100mg，水分多的样品如西瓜可多加一些）加至预热的裂解液CLB（已加有ß-巯基乙醇）离心管中，立即激烈涡旋30－60秒或者用吸头吹打混匀裂解，短时放回 65°C水浴中（5 min-10 min，时间稍长一点10分钟产量可能提高一些），中间偶尔颠倒1-2次帮助裂解。

ß-巯基乙醇是裂解液CLB的关键成分，必要的时候可以提高终浓度到10-20%。

3、振荡混匀后室温13,000rpm离心10分钟。

4、取裂解物上清（在不超过基因组DNA清除柱CC能力的情况下可以取更多的上清，这样可以提高产量）转到一个新离心管。

若上清表面有漂浮物，用吸头挑开吸取下面液体即可。

5、立刻接后续操作步骤。