1/适用范围：

适用于快速提取复杂植物组织细胞总RNA，使用独有基因组DNA清除柱技术可有效清除电泳可见gDNA残留，RNA可用于反转录PCR，荧光定量PCR等。

2/试剂盒组成、储存、稳定性：

本试剂盒在室温储存12个月不影响使用效果。

3/储存事项：

1、不合适的储存于低温（4℃或者－20℃）会造成溶液沉淀，影响使用效果，因此运输和储存均在室温下（15℃－25℃）进行。

2、避免试剂长时间暴露于空气中产生挥发、氧化、PH值变化，各溶液使用后应及时盖紧盖子。

4/产品介绍：

本公司在独家推出GenePure无苯酚、氯仿RNA快速提取技术基础上，又独家研发成功基因组DNA清除柱技术可以有效清除gDNA残留，得到的RNA一般不需要DNase消化，可用于反转录PCR、荧光定量PCR等实验。独特的裂解液迅速裂解细胞和灭活细胞RNA酶， 离心沉淀去除多糖多酚和次级代谢产物，然后裂解混合物用乙醇调节RNA结合吸附到基因组DNA清除柱，然后RNA被选择性洗脱滤过，吸附在基因组DNA清除柱上的残留DNA无法洗脱连同柱子一起丢弃从而清除掉DNA。滤过的RNA用乙醇调节结合条件后，RNA在高离序盐状态下选择性吸附于离心柱内硅基质膜，再通过一系列快速的漂洗－离心的步骤，去蛋白液和漂洗液将细胞代谢物，蛋白等杂质去除， 最后低盐的RNase free H20将纯净RNA从硅基质膜上洗脱。

5/产品特点：

1、完全不使用有毒的苯酚，氯仿等试剂，也不需要乙醇沉淀等步骤。

2、简捷，单个样品操作一般可在25分钟内完成，世界上最简单快速的试剂盒。

3、独家研发成功基因组DNA清除柱技术可以有效清除gDNA残留，得到的RNA一般不需要DNase消化，可用于反转录PCR、荧光定量PCR等实验。

4、适应性极其广泛，可以提取包括复杂中草药、复杂淀粉种子、复杂果实、复杂抗逆植物、复杂花卉、复杂多糖植物等数百种国内外试剂盒提取失败的样品。

5、多次柱漂洗确保高纯度，OD260/OD280典型的比值达1.9～2.2，基本无DNA残留,可用于RT-PCR，Northern-blot，二代测序和各种实验。

6/注意事项

1、所有的离心步骤均可在室温完成（4℃离心也可以），使用转速可以达到13,000 rpm的传统台式离心机。

2、需要自备β-巯基乙醇，乙醇，研钵(可选)。

3、样品处理量绝对不要超过基因组清除柱CC和和RNA吸附柱AC处理能力，否则造成DNA残留或产量降低。开始摸索实验条件时，如果不清楚样品DNA/RNA含量时可使用较少的样品处理量，将来根据样品试验情况增加或者减少处理量。

4、裂解液CLB和LBT Plus 和去蛋白液PRS中含有刺激性化合物，操作时戴乳胶手套，避免沾染皮肤，眼睛和衣服。若沾染皮肤、眼睛时，要用大量清水或者生理盐水冲洗。

5、关于DNA 的微量残留:

一般说来任何总RNA提取试剂在提取过程中无法完全避免DNA的微量残留（DNase消化也无法做到100%无残留），本公司的GenePure Plus RNA提取产品，由于采取了本公司独特的缓冲体系和基因组DNA清除柱技术，绝大多数DNA已经被清除，不需要DNase消化，可直接用于反转录PCR和荧光定量PCR。个别特殊情况如DNA含量过于丰富造成残留或者要进行严格的mRNA表达量分析荧光定量PCR，我们建议在进行模板和引物的选择时：

1. ① 选用跨内含子的引物，以穿过mRNA中的连接区，这样DNA就不能作为模板参与扩增反应。
2. ② 选择基因组DNA和cDNA上扩增的产物大小不一样的引物对。
3. ③ 将RNA提取物用RNase-free的DNase I 处理。本试剂盒还可以用于DNase I处理后的RNA清洁(cleanup) ，请联系我们索取具体操作说明书。
4. ④ 步骤去蛋白液PRS漂洗前，直接在吸附柱AC上进行DNase I柱上消化处理。购买DNA酶柱上消化试剂盒(货号：RE128)前可先索取具体操作说明书。

7/操作步骤：（实验前请先阅读注意事项）

提示：

    ● 第一次使用前请先在漂洗液RB瓶加入指定量无水乙醇!

    ● 取1ml裂解液 CLB至离心管内(如果CLB有析出或者沉淀需先置于65°C水浴重新溶解），在裂解液CLB中加入5% β-巯基乙醇（1ml CLB加50μl β-巯基乙醇）。颠倒混匀后65°C水浴中预热。多个样品按照比例放大准备。

1、直接研磨法（实验室无液氮情况下或者柔软易研磨植物样品推荐此法）:

a.  新鲜植物组织或者冰冻保存样品称重后取100-200mg（水分少的样品如叶片种子等可加100-150mg，水分多的样品如草莓西瓜果实可多加一些）迅速剪成小块放入研钵，加入 1ml CLB（已加有β-巯基乙醇）室温下充分研磨成匀浆，注意应该迅速研磨让组织和裂解液CLB立刻充分接触以抑制RNA酶活性。

β-巯基乙醇是裂解液CLB的关键成分，必要的时候可以提高终浓度到10-20%。

如果特别复杂植物，可以尝试在裂解液中加入PVP40至终浓度2%。

b.  将裂解物转入离心管，立即剧烈振荡15秒，短时放回 65°C水浴中（5-10 min），中间偶尔颠倒1-2次帮助裂解。13,000rpm离心10分钟，沉淀不能裂解的碎片。

c.  取裂解物上清（在不超过基因组DNA清除柱CC能力的情况下可以取更多的上清，这样可以提高产量）转到一个新离心管。加入上清体积一半的无水乙醇(0.5体积)，此时可能出现沉淀，但是不影响提取过程，立即吹打混匀，不要离心。

若上清表面有漂浮物，用吸头挑开吸取下面液体即可。

d.  立刻接操作步骤的步骤3。

2、液氮研磨法（适用广泛，提取复杂难破碎，易降解样品时推荐此法）:

a.  液氮中研磨新鲜或-70°C冷冻的材料至细粉。

b.  转移100-200mg细粉（水分少的样品如叶片种子等可加100-150mg，水分多的样品如草莓西瓜果实可多加一些）加至预热的裂解液CLB（已加有β-巯基乙醇）离心管中。立即剧烈涡旋30-60秒或者用吸头吹打混匀裂解直得到满意匀浆结果(或者电动匀浆30秒)，可以剪切DNA，降低粘稠度和提高产量。

c.  短时放回 65°C水浴中（5-10 min），中间偶尔颠倒1-2次帮助裂解。

d.  将裂解物13,000 rpm离心10分钟，沉淀不能裂解的碎片。

e.  取裂解物上清（在不超过基因组DNA清除柱CC能力的情况下可以取更多的上清，这样可以提高产量）转到一个新离心管。加入上清体积一半的无水乙醇(0.5体积)，此时可能出现沉淀，但是不影响提取过程，立即吹打混匀，不要离心。

若上清表面有漂浮物，用吸头挑开吸取下面液体即可。

f.  立刻接操作步骤的步骤3。

3、将混合物(每次小于720μl，多可以分两次加入)加入一个基因组清除柱CC中，（清除柱CC放入收集管CT中）13,000 rpm离心2分钟，弃掉废液。

确保离心后液体全部滤过去，膜上没有残留，如有必要，可以加大离心力和离心时间。

4、将基因组DNA清除柱CC放在一个干净2ml离心管内（不用RNAse free 或者DEPC处理，一般干净的新离心管即可。也可使用RNA吸附柱配套的新的干净收集管CT），在基因组清除柱CC内加500μl裂解液LBT Plus，13,000 rpm离心30秒， 收集滤液（RNA在滤液中），用微量移液器较精确估计滤过液体积（通常为450-500μl左右，滤过时候损失体积应该减去），加入0.5倍体积的无水乙醇，此时可能出现沉淀，但是不影响提取过程，立即吹打混匀，不要离心。

5、立刻将混合物(每次小于720μl，多可以分两次加入)加入一个吸附柱AC中，（吸附柱AC放入收集管CT中）13,000 rpm离心2分钟，弃掉废液。

确保离心后液体全部滤过去，膜上没有残留，如有必要，可以加大离心力和离心时间。

6、加700μl 去蛋白液PRS，室温放置1分钟，13,000rpm 离心30秒，弃掉废液。

7、加入500μl漂洗液RB（请先检查是否已加入无水乙醇!），13,000 rpm 离心30秒，弃掉废液。加入500μl漂洗液RB，重复一遍。

8、将吸附柱AC放回空收集管CT中，13,000 rpm离心2分钟，尽量除去漂洗液, 以免漂洗液中残留乙醇抑制下游反应。

9、取出吸附柱AC，放入一个RNase free离心管中，根据预期RNA产量在吸附膜的中间部位加30-50μl RNase free water（事先在 70-90℃水浴中加热可提高产量）， 室温放置1分钟，12,000 rpm 离心1分钟。

10、如果预期RNA产量>30μg，加30-50μl RNase free water重复步骤9，合并两次洗液，或者使用第一次的洗脱液加回到吸附柱重复步骤一遍(如果需要RNA浓度高)。

洗脱两遍的RNA洗脱液浓度高,分两次洗脱合并洗脱液的RNA产量比前者高15–30%,但是浓度要低,用户根据需要选择。

8/附录：RNA含量少样品或者RNA复杂产量低的解决方案     

可以提高样品处理量到300-500mg/2ml裂解液CLB，上清过两根基因组DNA清除柱CC，洗脱下来的RNA，可以两个合并到一根RNA吸附柱上，可以大大提高RNA浓度。