1/适用范围：

适用于快速提取凋亡DNA Ladder。 

2/试剂盒组成、储存、稳定性：

                             本试剂盒在室温储存12个月不影响使用效果。

3/储存事项:

① 裂解/结合液CB低温时可能出现析出和沉淀，可以在37℃水浴几分钟帮助重新溶解，恢复澄清透明后冷却到室温即可使用。

② 避免试剂长时间暴露于空气中产生挥发、氧化、pH值变化，各溶液使用后应及时盖紧盖子。

4/产品介绍：

细胞发生凋亡时，染色质DNA在核小体之间发生断裂，最终形成200bp整数倍的DNA片段，这些DNA片段被提取后，经电泳及溴化乙锭染色后形成梯子状外观，谓之DNA Ladder。血液和组织培养细胞在裂解/结合液中裂解后，释放出来的DNA片段在高离序盐状态下选择性吸附于离心柱内硅基质膜，再通过一系列快速的漂洗－离心的步骤，将盐、细胞代谢物、蛋白等杂质去除，最后低盐的洗脱缓冲液将DNA  Ladder片段从硅基质膜上洗脱。

5/产品特点：

① 不需要使用有毒的苯酚等试剂，也不需要乙醇沉淀等步骤。

② 本公司独有的裂解/结合液配方有效裂解细胞，使用本试剂盒不需要加入昂贵的蛋白酶K处理，大大降低了使用成本和加快了处理速度。

③ 节省时间，简捷，单个样品操作一般可在10分钟内完成。

6/注意事项

1、所有的离心步骤均在室温完成，使用转速可以达到13,000rpm的传统台式离心机。

2、开始实验前将需要的水浴先预热到70℃备用。

3、裂解/结合液CB含有刺激性化合物，操作时要戴乳胶手套，避免沾染皮肤，眼睛和衣服。若沾染皮肤、眼睛时，要用大量清水或者生理盐水冲洗。

4、一般2×106培养细胞DNA产量为10-20μg， 200μl人全血典型产量为3-6μg。

5、一般电泳检测时典型上样量为2-3μg纯化的DNA，如果凋亡率低，有可能只见到基因组DNA，而见不到DNA ladder，可以加大上样量。

7/操作步骤：（实验前请先阅读注意事项）

提示： 第一次使用前请先在漂洗液WB中加入指定量无水乙醇，充分混匀，加入后请及时在方框打钩标记已加入乙醇，以免多次加入!

1、取2×106个细胞（悬浮细胞或者组织培养细胞重悬在200μl PBS中）或者200μl全血（大约含有2×106个细胞）加入200μl 裂解/结合液CB，立刻涡旋振荡充分混匀。

可选做步骤: 如果RNA残留较多，影响凋亡DNA ladder的观察，可以在加入200μl裂解/结合液CB 前加20μl RNase A(25mg/ml)溶液，振荡混匀，室温放置5-10分钟。

细胞或者全血处理起始量最大可达300μl，如果起始量介于200μl-300μl之间，则需要按比例相应提高后面使用试剂量。

2、室温（15℃-20℃）放置10分钟。

3、加入100μl 异丙醇，立刻涡旋振荡充分混匀，此时可能会出现絮状沉淀。

上述步骤中适当力度充分混匀非常重要，混匀不充分严重降低产量。如果样品粘稠不易混匀，则可以涡旋振荡15秒。

4、将上一步混合物（包括可能有的沉淀）加入一个吸附柱DA中，（吸附柱放入收集管CT中）13,000rpm离心30秒，倒掉收集管CT中的废液。

5、加入600μl漂洗液WB（请先检查是否已加入无水乙醇!），12,000rpm 离心30秒，弃掉废液。

6、加入600μl漂洗液WB，12,000rpm 离心30秒，弃掉废液。

7、将吸附柱DA放回空收集管CT中，13,000rpm离心2分钟，尽量除去漂洗液， 以免漂洗液中残留乙醇影响洗脱效率和下游反应。

8、取出吸附柱DA，放入一个干净的离心管中，在吸附膜的中间部位加100μl洗脱缓冲液EB（洗脱缓冲液事先在 65-70℃水浴中预热）， 室温放置3-5分钟，12,000rpm 离心1分钟。将得到的溶液重新加入离心吸附柱中，室温放置2分钟，12,000rpm离心1分钟。

洗脱体积越大，洗脱效率越高，如果需要DNA浓度较高，可以适当减少洗脱体积， 但是最小体积不应少于50μl，体积过小降低DNA洗脱效率，减少DNA产量。

9、DNA可以直接使用或者存放在－20℃，但是不要超过14天。

10、取大约2-3μg纯化的DNA电泳检测（注意200μl人全血典型产量只有3-6μg）。

8/问题与解决方法: