1/试剂盒组成、储存、稳定性:
试剂盒组成
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保存
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100次(DE124-01)
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固定液FS
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4℃
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50 ml
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100×染色浓缩液DC
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4℃避光
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0.5 ml
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染色稀释缓冲液DS
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4℃或者室温
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50 ml
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本产品收到后按照上面指示温度存放各成份 ,6个月内有效。
2/产品介绍:
凋亡中晚期细胞形态学变化为染色质在局部区域凝集,固缩,继而核碎裂出现凋亡小体。在Hoeschst染色下,细胞核或者凋亡小体的DNA会呈现致密浓染或者碎块状致密浓染。本试剂盒Hoechst染料紫外光激发波长350-370 nm;发射波长465 nm,在荧光显微镜下DNA发出蓝色荧光。
3/注意事项:
1、需可以观察蓝色荧光的荧光显微镜或激光共聚焦显微镜。
2、需PBS或0.9%NaCl溶液,盖玻片与载玻片。
3、荧光容易淬灭,应该尽量避光操作和保存。
4/操作步骤:(实验前请先阅读注意事项)
贴壁细胞
1、取普通洁净盖玻片于70%乙醇中浸泡5分钟或更长时间,无菌超净台内吹干或用细胞培养级PBS或0.9%NaCl等溶液洗涤三遍,再用细胞培养液洗涤一遍。将盖玻片置于六孔板内,种入细胞培养过夜,使约为50%-80%满。
2、刺激细胞发生凋亡后,吸尽培养液,加入0.5ml固定液FS,固定10分钟或更长时间(可4℃过夜)。
本试剂盒使用固定液FS主要为4%多聚甲醛,如果不适合您的细胞或者效果不佳,很多种固定配方如细胞固定液FS『甲醇:冰乙酸( 3∶1 )现配』,都可以使用,可以根据自己细胞特点选用适合的固定方法。
3、去固定液FS,用PBS或0.9%NaCl洗两遍,每次3分钟,吸尽液体。洗涤时宜用摇床,或手动晃动数次。
4、取5μl 100×染色浓缩液DC与0.5ml染色稀释缓冲液DS混合后加入染色5-10分钟,也宜用摇床,或手动晃动数次。
5、用PBS或0.9%NaCl洗两遍,每次3分钟。
6、滴一滴封片液于载玻片上,盖上贴有细胞的盖玻片,尽量避免气泡。使细胞接触封片液,切勿弄反。荧光显微镜可检测到呈蓝色的细胞核。激发波长在350nm左右,发射波长在460nm左右。
封片液可使用50%PBS/50%甘油(等体积混合),如果荧光淬灭太快影响观察,应该选用商品化的抗荧光淬灭封片液。
悬浮细胞
1、离心收集细胞样品于1.5ml离心管内,加入0.5ml固定液FS,缓缓悬起细胞,固定10分钟或更长时间(可4℃过夜)。
2、离心去固定液FS,用PBS或0.9%NaCl洗两遍,每次3分钟。洗涤期间手动晃动。
3、最后一次离心后吸去大部分液体保留约50μl 液体,再缓缓悬起细胞,滴加至载玻片上,尽量使细胞分布均匀。
4、稍晾干,使细胞贴在载玻片上不易随液体流动。
5、取5μl 100×染色浓缩液DC与0.5ml染色稀释缓冲液DS混合后均匀滴上染色5-10分钟,用吸水纸从边缘吸去液体,微晾干。
6、用PBS或0.9%NaCl洗两遍,每次3分钟。
7、和贴壁细胞一样封片观察。
组织切片
1、对于任何常见切片,处理至常规可以进行免疫染色时,或完成常规的免疫染色后,即可进行后续的Hoeschst染色。
2、PBS或0.9%NaCl洗两遍,每次3分钟,吸尽液体。洗涤时宜用摇床,或手动晃动数次。可在六孔板中操作。
3、取5μl 100×染色浓缩液DC与0.5ml染色稀释缓冲液DS混合后加入染色5-10分钟,也宜用摇床,或手动晃动数次。
4、用PBS或0.9%NaCl洗两遍,每次3分钟。
5、和贴壁细胞一样封片观察。