1/适用范围：

适用于提取凋亡DNA Ladder。 

2/试剂盒组成、储存、稳定性：

3/注意事项：

为保持活性方便运输，Enzyme B客户收到时为冻干粉，收到后加500µl灭菌水（25次）或者1ml灭菌水（50次）溶解后－20 ºC保存。Enzyme A和Enzyme B为酶溶液，应该避免反复冻融降低活性，如果要分多次使用，最好按照每次使用量分装后－20 ºC保存。

4/产品介绍：

凋亡(apoptosis)或程序性死亡的细胞一个形态学的显著特点是染色体DNA以核小体为单位（185 bp）规律断裂形成长度约为n×185bp (n=1,2,3,4…) 的DNA片段，经琼脂糖凝胶电泳显示为阶梯状凋亡DNA Ladder，是凋亡细胞最直观的特征。本试剂盒选择性从组织和细胞中分离提取凋亡DNA ladder，通过选择性分离基因组DNA与凋亡DNA ladder，最大限度的减少了基因组DNA对凋亡DNA ladder的观察干扰，因此显著的提高了检测敏感度，反应可在微量离心管进行，2.5小时完成，快速方便；无需有机抽提，检测灵敏度极高，可从约2000个凋亡细胞中检测到DNA ladder。推荐起始细胞量为5～10 × 105 个，但投入的细胞量可在1 × 105 ~ 5 × 106之间变化。原则是总细胞中应含有至少约1～2 × 104个凋亡细胞。多于2 × 104个凋亡细胞通常可获得十分清晰的凋亡DNA ladder。本试剂盒也可用于从组织中提取凋亡DNA ladder。但与培养细胞相比，整体动物组织凋亡细胞出现的时间、部位、程度等规律性差往往造成难以准确取材，可能显著影响实验结果。但只要组织确实发生凋亡，有经验的用户也可以使用本试剂盒从组织提取凋亡DNA ladder (参见说明4)。

5/产品说明:

① 溴化乙锭染色过度将降低DNA条带检测灵敏度，可用水冲洗凝胶10～30分钟。如冲洗过头可再用溴化乙锭复染。可用更灵敏的DNA染色剂SYBR Green。也可进行丙烯酰胺DNA凝胶电泳和DNA银染。

② 对细胞进行干预处理后，凋亡可能仅在某一时间点或某一干预强度下最为明显。需要进行预试验确定最佳干预时间或强度。此时也可用凋亡小体/hoeschst染色试剂盒(DN1801)快速染色凋亡小体观察。

③ 推荐起始细胞量为5～10 × 105 个，但投入的细胞量可在1 × 105 ~ 5 × 106之间变化。原则是总细胞中应含有至少约1～2 × 104个凋亡细胞。多于2 × 104个凋亡细胞通常可获得十分清晰的凋亡DNA ladder。六孔板的一个孔相当于一个35 mm培养皿长满后可得到1～10 ×105 个细胞，如果细胞凋亡发生率为10%，经过处理可得到约1～10 × 104个凋亡细胞，应该足以获得清晰的凋亡DNA ladder。反之如果不能从>3 ×106个细胞获得清晰的凋亡DNA ladder，表明其中凋亡细胞少于1%。此时增加细胞用量也难已奏效。

④ 从组织块提取凋亡DNA ladder。取10～20 mg组织块放入小玻璃匀浆器，加100～200μl Extraction buffer，上下手动匀浆15～20次。取出匀浆液，冰上5～10 min。振荡10秒。4500 rpm 10分钟收集上清液并转移到新1.5ml离心管，执行提取步骤3。另外一种方法是将30～50mg组织剪碎后在PBS里面匀浆，制成细胞悬液，离心收集细胞后接步骤2继续执行提取。

⑤ 采用高质量琼脂糖，使用宽度较小和厚度较窄的样品梳子，制作较薄的琼脂糖凝胶(厚度约2～4 mm)；用较低的电压进行慢速电泳，将显著增加凋亡DNA条带检测灵敏度。电泳距离不要太长，否则将使小的凋亡DNA条带弥散而降低分辨率。

6/操作步骤：

1、用PBS漂洗细胞两遍后微型离心机500 ×g 4ºC 5 min收集5～10 × 105个细胞（最好同时做一个未凋亡细胞的对照）。小心用移液枪吸弃上清，除尽管壁附着液体。

2、将离心管底部的细胞沉淀用手指轻轻弹松打散后，加入100µl的Extraction buffer，用振荡器激烈混合10秒钟后，1,100～1,600 xg(约3500～4500 rpm)离心5分钟。

3、勿触动管底沉淀，将上清液转移到新的1.5ml离心管。

4、沉淀按操作2.方法再重复一次。

5、把上清液与操作3.的上清液合并于一起共约200µl，作为粗提取液(含有凋亡DNA片段，未凋亡染色体DNA已经通过沉淀去除)。

6、向粗提取液中加入10% SDS 溶液 20µl后，再加入Enzyme A 20µl，混匀，56℃温育1小时。

7、向上述混合液中加入Enzyme B 20µl，混匀，37℃温育1小时，或者直到变得透亮（可过夜）。

8、向上述混合液中加入Precipitant 130µl后，颠倒混匀，再加入1 ml的乙醇，混匀后- 20℃放置1小时以上（沉淀凋亡DNA片段）。

9、至少13000rpm 4ºC离心15min，弃上清，加1ml 70％乙醇漂洗一遍后离心，倒去乙醇，并且尽量吸除管壁附着液体。敞开管口，室温晾干沉淀。

10、用17µl双蒸水或TE Buffer充分溶解沉淀，加3µl 6 x DNA凝胶上样缓冲液震荡混匀。取全部20µl 上样或者适量上样进行1% agarose gels电泳。溴化乙锭染色，紫外观察照相（凋亡发生率较低时，添加过量TE Buffer溶解沉淀有可能会导致浓度太稀，无法检出DNA Ladder，因此可减少用量，反之，可增加）。