一、适用范围：

适用于快速提取各种土壤基因组DNA。

二、试剂盒组成、储存、稳定性：

                                      本试剂盒在室温储存12个月不影响使用效果。

三、储存事项:

① 溶液L或者抑制物去除液IR低温时可能出现析出和沉淀，可以在37℃水浴几分钟帮助重新溶解，恢复澄清透明后冷却到室温即可使用,注意不要剧烈摇晃，以免产生大量气泡。

② 为避免降低活性，方便运输，提供蛋白酶K为冻干粉状，收到后，可短暂离心后，加入1ml灭菌水溶解，因为反复冻融可能会降低酶活性，因此溶解后立即按照每次使用量( 20μl )分装冻存，－20℃保存。

③ 避免试剂长时间暴露于空气中产生挥发、氧化、pH值变化，各溶液使用后应及时盖紧盖子。

四、产品介绍：

普通的手提或者试剂盒提取的土壤基因组DNA由于常常残留有PCR的强烈抑制物如腐殖酸、棕黄酸等杂质造成实验失败，此外，由于采用了剧烈的玻璃珠击打来破裂菌体，常常造成DNA剪切和降解。本公司经过长期研发开发出了具有自主知识产权的土壤基因组DNA，通过专利配方的腐殖酸和棕黄酸去除试剂配合特殊处理的纯化柱，可以最大程度的去除这些杂质，同时加上多次柱漂洗，确保得到的DNA具有极高纯度，此外独特的抽提和裂解体系可以迅速裂解细胞（壁）和灭活细胞内核酸酶，不需要借助玻璃珠破壁，有效保证了基因组DNA的完整性。

五、产品特点：

① 本公司独有的专利配方和纯化柱能有效去除腐殖酸等杂质。

② 不需要借助玻璃珠破壁，有效保证了基因组DNA的完整性，长度可达30kb -50kb，可直接用于PCR，Southern-blot和各种酶切反应。

③ 兼容性强，适用于各种不同的土壤包括淤泥等提取困难的土壤。

④ 多步骤去除各种杂质和抑制物，保证极高纯度，OD260/OD280典型的比值达1.7～1.9。

⑤ 不需要使用有毒的苯酚等试剂，也不需要乙醇沉淀等步骤。

⑥ 快速，简捷，单个样品操作一般可在60分钟内完成。

六、注意事项：

① 所有的离心步骤均在室温完成，使用转速可以达到13,000rpm的传统台式离心机。

② 开始实验前根据需要将水浴预热到37℃或者70℃备用。

③ 溶液C和抑制物去除液IR中含有刺激性化合物，操作时要戴乳胶手套，避免沾染皮肤，眼睛和衣服。若沾染皮肤、眼睛时，要用大量清水或者生理盐水冲洗。

④ 洗脱液EB不含有螯合剂EDTA，不影响下游酶切、连接等反应。也可以使用水洗脱，但应该确保批pH大于7.5， pH过低影响洗脱效率。用水洗脱DNA应该保存在－20℃。DNA如果需要长期保存，可以用TE缓冲液洗脱（10mM Tris-HCl， 1mM EDTA，pH 8.0），但是EDTA可能影响下游酶切反应，使用时可以适当稀释。

七、操作步骤：（实验前请先阅读注意事项）

提示：第一次使用前请先在漂洗液WB和溶液C中加入指定量无水乙醇，充分混匀，加入后请及时在方框打钩标记已加入乙醇，以免多次加入!

1、 取0.2g 土壤放入离心管，用牙签或者枪头捣碎后加入0.5ml溶液S，用枪头搅拌后短暂涡旋帮助重悬。如果预计土壤里面含有较多难裂解的菌类如革兰氏阳性菌，可先在0.5ml溶液S里面加入10mg的溶菌酶，吹打混匀后再加入，并加做步骤2。

2、（可选步骤）:37℃温育30分钟，每10分钟颠倒混匀几次。对于难裂解的菌类如革兰氏阳性菌含量丰富的土壤，并在上一步骤加入了溶菌酶的样品，需要加做此步骤来帮助裂解。 

3、加入20μl蛋白酶K (20mg/ml)溶液，短暂涡旋帮助混匀。可选做步骤: 为提高产量，可以在37℃振荡10分钟或者涡旋振荡2分钟。（注意涡旋振荡可能剪切DNA）

4、加入120μl 溶液L，短暂涡旋混匀，65℃温育30分钟，期间颠倒混匀几次。65℃温育时间可以根据具体样品种类和产量进行延长或者缩短以取得最佳产量和纯度，可在10分钟－2小时范围内调整。

5、（可选步骤）:于－70℃冷冻，65℃融化，反复3次。对于难裂解的菌类如革兰氏阳性菌含量丰富的土壤， 可加做此步骤来帮助裂解。 

6、颠倒混匀后，13,000 rpm离心2分钟,小心转移上清至新的离心管（记录上清体积）。

7、加入1/3(三分之一)体积的溶液A,颠倒几次，涡旋5秒混匀后，冰上放置5分钟。

8、13,000 rpm离心5分钟,小心转移上清至新的离心管（记录上清体积）。

9、加入1/3(三分之一)体积的溶液B,颠倒几次，短暂涡旋混匀后，冰上放置5分钟。该步骤主要是进一步去除humic substance等PCR抑制物质以提高纯度，但是会降低一些产量，如果对产量要求高或者提取的DNA不用于PCR，可以尝试略去此步骤以提高产量。如果预计土壤成份复杂PCR抑制物质多，可以适当提高溶液B加入量(如加入等体积的溶液B)，可以提高纯度，但是注意也会显著降低产量。

10、13,000 rpm离心5分钟,小心转移上清至新的离心管（记录上清体积）。

11、加入1.5倍体积的溶液C（请先检查是否已加入无水乙醇!）,颠倒几次，短暂涡旋混匀。

12、将上一步混合物700μl（包括可能有的沉淀）加入一个吸附柱DA中，（吸附柱放入收集管CT中），12,000rpm离心30-60秒，倒掉收集管CT中的废液。重复直到所有的混合物都加完。

13、加入500μl抑制物去除液IR，12,000 rpm 离心30秒，弃废液。

14、加入600μl漂洗液WB（请先检查是否已加入无水乙醇!），12,000 rpm 离心30秒，弃掉废液。

15、加入600μl漂洗液WB，12,000 rpm 离心30秒，弃掉废液。

16、将吸附柱DA放回空收集管CT中，13,000 rpm离心2分钟，尽量除去漂洗液，以免漂洗液中残留乙醇抑制下游反应。

17、取出吸附柱DA，放入一个干净的离心管中，在吸附膜的中间部位加100μl洗脱缓冲液EB（洗脱缓冲液事先在 65-70℃水浴中预热效果更好）， 室温放置3-5分钟，12,000 rpm 离心1分钟。将得到的溶液重新加入离心吸附柱中，室温放置2分钟，12,000 rpm离心1分钟。洗脱体积越大，洗脱效率越高，如需要DNA浓度较高，可以适当减少洗脱体积， 但是最小体积不应少于50μl，体积过小降低DNA洗脱效率，减少DNA产量。

18、DNA可以存放在2-8℃,如果要长时间存放，可以放置在－20℃。