1/适用范围:
适用于快速提取真菌组织细胞基因组DNA。
2/试剂盒组成、储存、稳定性:
试剂盒组成
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保存
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50次
(DE128-01)
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100次
(DE128-02)
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RNase A(10mg/ml)
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-20℃
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250 μl
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500 μl
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缓冲液A
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室温
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25 ml
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50 ml
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缓冲液B
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室温
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10 ml
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20 ml
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缓冲液C
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室温
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15 ml
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25 ml
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第一次使用前按说明加指定量乙醇
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漂洗液WB
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室温
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15 ml
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25ml
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第一次使用前按说明加指定量乙醇
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洗脱缓冲液EB
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室温
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15 ml
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20 ml
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吸附柱DA
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室温
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50个
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100个
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收集管CT(2ml)
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室温
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50个
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100个
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本试剂盒在室温储存12个月不影响使用效果。
3/储存事项:
① 缓冲液A、C低温时可能出现析出和沉淀,可以在65℃水浴几分钟帮助重新溶解(缓冲液C加入乙醇前可加热,加入乙醇后不可加热),恢复澄清透明后冷却到室温即可使用。
② 避免试剂长时间暴露于空气中产生挥发、氧化、pH值变化,各溶液使用后应及时盖紧盖子。
4/产品介绍:
该试剂盒采用DNA吸附柱和新型独特的溶液系统,适合于从真菌组织细胞中快速简单地提取基因组DNA。可在30分钟内完成一个或多个100mg新鲜或20mg干燥的真菌样品DNA的纯化工作。提取过程不需要用到有毒的酚氯仿等有机物抽提,也不需要用到耗时的异丙醇或乙醇沉淀,并能快速高效地去除多糖类、酚类和酶抑制物等杂质,纯化的DNA可直接用于PCR、酶切和杂交等实验。
新鲜或干燥的真菌组织(细胞)磨碎后经裂解液裂解;蛋白质、多糖、细胞残片被沉淀去除;然后基因组DNA在高离序盐状态下选择性吸附于离心柱内硅基质膜, 再通过一系列快速的漂洗-离心的步骤, 进一步将多糖,多酚和细胞代谢物,蛋白等杂质去除, 最后低盐的洗脱缓冲液将纯净基因组DNA从硅基质膜上洗脱。
5/产品特点:
① 离心吸附柱内硅基质膜全部采用特制吸附膜,柱与柱之间吸附量差异极小,可重复性好。
② 不需要使用有毒的苯酚等试剂,也不需要乙醇沉淀等步骤。
③ 快速,简捷,单个样品操作一般可在1小时内完成。
④ 数种去多糖、多酚成份和多次柱漂洗确保高纯度,OD260/OD280典型的比值达1.7~1.9,可直接用于PCR,Southern-blot和各种酶切反应。
6/注意事项:
① 所有的离心步骤均在室温完成,使用转速可以达到13,000 rpm的传统台式离心机。
② 开始实验前将需要的水浴先预热到65℃备用。
③ 缓冲液C中含有刺激性化合物,操作时要戴乳胶手套,避免沾染皮肤,眼睛和衣服。若沾染皮肤、眼睛时,要用大量清水或者生理盐水冲洗。
④ 不同来源的真菌组织细胞材料中提取DNA 的量会有差异,一般100mg新鲜组织典型产量可达3-25μg。
⑤ 洗脱液EB不含有螯合剂EDTA, 不影响下游酶切、连接等反应。也可以使用水洗脱, 但应该确保pH大于7.5, pH过低影响洗脱效率。用水洗脱DNA应该保存在-20℃。DNA如果需要长期保存,可以用TE缓冲液洗脱 (10mM Tris-HCl, 1mM EDTA,pH 8.0),但是EDTA可能影响下游酶切反应,使用时可以适当稀释。
7/操作步骤:(实验前请先阅读注意事项)
提示:● 第一次使用前请先在漂洗液WB中加入指定量无水乙醇,充分混匀,加入后请及时在方框打钩标记已加入乙醇,以免多次加入!
● 第一次使用前请先在缓冲液C中加入指定量无水乙醇!
1、取适量真菌组织在研钵中加入液氮充分碾磨成细粉。
2、转移细粉(新鲜真菌组织100 mg 或干重组织20 mg)到一个1.5ml离心管,不要解冻,加入400μl缓冲液A 和4μl RNase A(10 mg/ml),旋涡振荡,充分混匀帮助裂解。
如果组织裂解困难,可根据需要加一个轻柔匀浆10秒的步骤帮助裂解。大多数情况下不需要离心去除未完全裂解的组织,因为后面有一个离心去除的步骤。
可选:多糖含量特别高的时候可以在缓冲液A加入2%PVP40,000; 多酚含量特别高的时候可以在缓冲液A中加入0.2% beta巯基乙醇。也可两者同时加入。
3、65℃水浴10分钟,在水浴过程中颠倒离心管2-3次,混合样品。
4、加入130 μl 缓冲液B,充分混匀,冰上放置5分钟, 14,000 rpm 离心5-10 分钟,小心吸取上清到一个新的1.5ml离心管,注意不要吸到界面物质。
5、计算上清量,加入1.5倍体积的缓冲液C(请先检查是否已加入无水乙醇!),立即吹打混匀。
加入缓冲液C可能会出现絮状沉淀,但不影响DNA提取。注意将缓冲液C直接加入到上清并立即吹打混匀。
6、将上一步所得混合物(包括可能出现的沉淀)加入一个吸附柱DA中,(吸附柱DA放入收集管CT中)13,000 rpm离心30-60秒,倒掉收集管CT中的废液(先加650μl离心,弃废液,再加入剩余的溶液,再次离心)。
7、加入600μl漂洗液WB(请先检查是否已加入无水乙醇!),12,000 rpm 离心30秒,弃掉废液。
8、加入600μl漂洗液WB,12,000 rpm 离心30秒,弃掉废液。
9、将吸附柱DA放回空收集管CT中,13,000 rpm离心2分钟,尽量除去漂洗液, 以免漂洗液中残留乙醇抑制下游反应。
10、取出吸附柱DA,放入一个干净的离心管中,在吸附膜的中间部位加100μl洗脱缓冲液EB, 室温放置3-5分钟,12,000 rpm 离心1分钟。将得到的溶液重新加入吸附柱中,室温放置2分钟,12,000 rpm离心1分钟。
洗脱体积越大,洗脱效率越高,如果预计和需要产量高,可增大洗脱体积,如果需要DNA浓度较高,可以适当减少洗脱体积, 但是最小体积不应少于50μl,体积过小降低DNA洗脱效率,减少DNA产量。
11、DNA可以存放在2-8℃,如果要长时间存放,可以放置在-20℃。
8/问题与解决方法
问题
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评论与建议
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DNA产量低
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*处理材料过量或者裂解不完全
-建议:使用适量的起始材料,充分研磨或者匀浆
*结合条件不恰当
-建议:步骤5精确估计上清量,加入1.5倍体积缓冲液C量要准确
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RNA残留
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*真菌RNA含量太丰富
-建议:提高RNase A处理浓度
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未提取到DNA
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*漂洗液WB中忘记加无水乙醇
-建议:第一次实验时,在漂洗液WB中加入指定量无水乙醇。
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离心柱堵塞
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*研磨裂解不充分,团块多;裂解物太粘稠;离心力太小
-建议:参见步骤2,加一个离心步骤去除;减低起始材料量,不要处理过量,加大离心力
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洗脱下来的
DNA溶液带颜色
或者膜上有明显
的色素残留
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*漂洗次数不够
-建议:步骤8完成后,加500μl乙醇再漂洗一遍
*起始材料太多过量
-建议:减少起始处理材料,不要过量
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洗脱下来的
DNA产量低
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*离心柱残留有较多乙醇或者底部不慎沾有乙醇
-建议:确保做了步骤9,否则残留乙醇会影响洗脱效率。
*使用了水或者其它非最佳液体代替洗脱缓冲液
-建议:仔细阅读步骤10和注意事项5和只使用洗脱缓冲液EB洗脱。
*洗脱缓冲液量偏低
-建议:使用200μl洗脱缓冲液洗脱
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A260吸光值
异常偏高
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*一些硅基质膜成分一起洗脱下来,干扰了吸光值
-建议:将洗脱的基因组DNA溶液13,000rpm再离心一分钟,小心取上清使用。
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DNA下游酶切
不能切开或者
酶切不完全
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*一些硅基质膜成分一起洗脱下来,抑制了酶切反应
-建议:将洗脱的基因组DNA溶液13,000rpm再离心一分钟,小心取上清使用。
*离心柱残留有较多乙醇或者底部不慎沾有乙醇抑制了酶切反应
-建议:确保做了步骤9,然后空气中晾几分钟,让残留乙醇挥发。
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