一、适用范围:
适用于快速提取各种福尔马林固定和石蜡包埋组织DNA。
二、试剂盒组成、储存、稳定性:
试剂盒组成
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保存
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50次
(DE134-01)
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100次
(DE134-02)
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裂解液FTL
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室温
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11 ml
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20 ml
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结合液CB
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室温
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11 ml
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20 ml
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抑制物去除液IR
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室温
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25 ml
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50 ml
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漂洗液WB
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室温
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15 ml
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25 ml
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第一次使用前按说明加指定量乙醇
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洗脱缓冲液EB
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室温
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15 ml
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15 ml
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蛋白酶K粉
30mg/ml
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-20℃
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30mg
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60mg
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吸附柱DA
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室温
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50个
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100个
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收集管CT(2ml)
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室温
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50个
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100个
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本试剂盒在室温储存12个月不影响使用效果。
三、储存事项:
结合液CB或者抑制物去除液IR低温时可能出现析出和沉淀,可以在37℃水浴几分钟帮助重新溶解,恢复澄清透明后冷却到室温即可使用。
为避免降低活性、方便运输,提供蛋白酶K为冻干粉状,收到后,可短暂离心后,10mg/20mg加入0.5ml/1ml灭菌水溶解,因为反复冻融可能会降低酶活性,因此溶解后立即按照每次使用量分装冻存,-20℃保存。
避免试剂长时间暴露于空气中产生挥发、氧化、pH值变化,各溶液使用后应及时盖紧盖子。
四、产品介绍:
福尔马林固定或者石蜡包埋组织通过独特裂解液热处理和蛋白酶K共同作用迅速裂解细胞释放出基因组DNA,然后基因组DNA在高离序盐状态下选择性吸附于离心柱内硅基质膜, 再通过一系列快速的漂洗-离心的步骤, 抑制物去除液和漂洗液将细胞代谢物、蛋白等杂质去除, 最后低盐的洗脱缓冲液将纯净基因组DNA从硅基质膜上洗脱。
五、产品特点:
① 离心吸附柱内硅基质膜全部采用世界著名公司特制吸附膜,柱与柱之间吸附量差异极小,可重复性好。
② 不需要使用有毒的苯酚等试剂,也不需要乙醇沉淀等步骤。
③ 快速,简捷,单个样品操作一般可在30分钟内完成。
④ 多次柱漂洗确保高纯度,OD260/OD280典型的比值达1.7~1.9,长度可达30kb -50kb,可直接用于PCR,Southern-blot和各种酶切反应。
六、注意事项:
① 所有的离心步骤均在室温完成,使用转速可以达到13,000rpm的传统台式离心机。
② 需要自备乙醇(需要准备100%/80%/60%/40%不同浓度)或者二甲苯。
③ 实验前将需要的水浴先预热到37℃备用。
④ 结合液CB和抑制物去除液IR中含有刺激性化合物,操作时要戴乳胶手套,避免沾染皮肤,眼睛和衣服。若沾染皮肤、眼睛时,要用大量清水或者生理盐水冲洗。
⑤ 洗脱液EB不含有螯合剂EDTA,不影响下游酶切、连接等反应。也可以使用水洗脱,但应该确保批pH大于7.5, pH过低影响洗脱效率。用水洗脱DNA应该保存在-20℃。DNA如果需要长期保存,可以用TE缓冲液洗脱(10mM Tris-HCl, 1mM EDTA,pH 8.0),但是EDTA可能影响下游酶切反应,使用时可以适当稀释。
七、操作步骤:(实验前请先阅读注意事项)
提示:第一次使用前请先在漂洗液WB中加入指定量无水乙醇,充分混匀,加入后请及时在方框打钩标记已加入乙醇,以免多次加入!
1、将组织切片放入离心管子,浸泡在二甲苯中脱蜡约30分钟(具体时间根据切片厚度调整)。
2、将切片依次放入100%乙醇/80%乙醇/60%乙醇/40%乙醇/去离子水,每个液体中浸泡10秒钟重新水化切片。刚放入100%乙醇时,应该见到切片变白。
3、显微镜观察下,用刀片切下拟提取DNA的目标组织,放入预先称重的1.5ml离心管。再次称重,计算出切片组织重量。
4、在25-50mg组织中加入200μl裂解液FTL,再加入20μl的蛋白酶K溶液(20mg/ml),立即混匀混匀后置37℃水浴过夜。
5、再加入10μl的蛋白酶K溶液(20mg/ml),混匀后55℃水浴1-2小时。此步骤后,不应该出现粗大的组织颗粒。
6、加入200μl 结合液CB,立刻涡旋振荡20秒充分混匀后置70℃水浴10分钟。
7、冷却后加入100μl 异丙醇,立刻涡旋振荡30秒充分混匀,此时可能会出现絮状沉淀。
8、用1毫升的枪头吸取混合物,将混合物加入一个吸附柱DA中,(吸附柱放入收集管CT中)13,000rpm离心60秒,倒掉收集管CT中的废液。如果有不溶组织物可能堵住枪头,可将枪头在吸水纸上轻蹭去除不溶物;如果吸上来的混合物少则可以将枪头和不溶物一起弃去,该做法是为了去除不溶物,以免堵塞离心柱。
9、加入500μl抑制物去除液IR,12,000rpm 离心30秒,弃废液。
10、加入600μl漂洗液WB(请先检查是否已加入无水乙醇!),12,000rpm 离心30秒,弃掉废液。
11、加入600μl漂洗液WB,12,000rpm 离心30秒,弃掉废液。
12、将吸附柱DA放回空收集管CT中,13,000rpm离心2分钟,尽量除去漂洗液, 以免漂洗液中残留乙醇抑制下游反应。
13、取出吸附柱DA,放入一个干净的离心管中,在吸附膜的中间部位加100μl洗脱缓冲液EB (洗脱缓冲液事先在65-70℃水浴中预热效果更好), 室温放置3-5分钟,12,000rpm 离心1分钟。将得到的溶液重新加入离心吸附柱中,室温放置2分钟,12,000rpm离心1分钟。
洗脱体积越大,洗脱效率越高,如果需要DNA浓度较高,可以适当减少洗脱体积, 但是最小体积不应少于50μl,体积过小降低DNA洗脱效率,减少DNA产量。
14、DNA可以存放在2-8℃,如果要长时间存放,可以放置在-20℃。
八、附录:另外一种脱蜡方式
1、将目标组织切片放入离心管,加入1ml 100%二甲苯,涡旋振荡10秒。瞬间离心把组织全部浸入到二甲苯。
2、50℃水浴3分钟熔解石蜡,20-25℃最高速离心2分钟,收集组织到管底。
3、小心用移液器吸弃上清二甲苯,注意不要吸到沉淀。
4、加入1ml无水乙醇,涡旋振荡,最高速离心2分钟,小心吸弃上清乙醇。
5、加入1ml无水乙醇,重复步骤4,尽可能吸弃所有乙醇。
6、室温或者37℃ 晾干乙醇10分钟或直到所有乙醇挥发干。
九、问题与解决方法:
问题
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评论与建议
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DNA产量低
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*组织块太大,蛋白酶K消化不完全
-建议:液氮研磨或者尽量将组织切成小块,或者延长蛋白酶K消化时间至过夜或者在原有消化基础上另加20μl蛋白酶K消化1-2小时。
*蛋白酶K失效了
-建议:收到蛋白酶K后,按照每次使用量分装冻存,避免反复冻融。
*裂解不完全或者和异丙醇没有充分混匀
-建议:加入结合液后,和加入蛋白酶K后立即吹打或者涡旋混匀;加入异丙醇后立即吹打或者涡旋混匀才加入吸附柱,如果太粘稠必须涡旋振荡15秒充分混匀。
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组织DNA
降解了
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*组织中核酸酶活性导致降解
-建议:样品处理前妥善保存在-20℃,处理量不要过量。
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未提取到DNA
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*漂洗液WB中忘记加无水乙醇
-建议:第一次实验时,在漂洗液WB中加入指定量无水乙醇。
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洗脱下来的
DNA产量低
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*离心柱残留有较多乙醇或者底部不慎沾有乙醇
-建议:确保做了步骤12,否则残留乙醇会影响洗脱效率。
*使用了水或者其它非最佳液体代替洗脱缓冲液
-建议:仔细阅读仔细阅读注意事项5和步骤13和只使用洗脱缓冲液EB洗脱。
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A260吸光值
异常偏高
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*一些硅基质膜成分一起洗脱下来,干扰了吸光值
-建议:将洗脱的基因组DNA溶液13,000rpm再离心一分钟,小心取上清使用。
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DNA下游酶切
不能切开或者
酶切不完全
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*一些硅基质膜成分一起洗脱下来,抑制了酶切反应
-建议:将洗脱的基因组DNA溶液13,000rpm再离心一分钟,小心取上清使用。
*离心柱残留有较多乙醇或者底部不慎沾有乙醇抑制了酶切反应
-建议:确保做了步骤7,然后空气中晾几分钟,让残留乙醇挥发。
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