1/适用范围：
适用于快速λ噬菌体DNA。
2/试剂盒组成、储存、稳定性：
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试剂盒组成
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保存
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50次
（DE126-01）
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100次
（DE126-02）
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RNase A
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-20℃
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20 mg
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20 mg X 2
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DNase I
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-20℃
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50 mg
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50 mg X 2
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噬菌体沉淀液PB
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室温
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100 ml
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100ml X 2
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裂解缓冲液LS
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室温
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30 ml
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60 ml
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杂质沉淀液IP
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室温
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5 ml
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10 ml
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结合液LB
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室温
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20 ml
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40 ml
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漂洗液WB
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室温
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15 ml
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25 ml
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第一次使用前按说明加指定量乙醇
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洗脱缓冲液EB
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室温
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10 ml
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15 ml
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吸附柱DA
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室温
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50个
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100个
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收集管CT（2ml）
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室温
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50个
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100个
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本试剂盒在室温储存12个月不影响使用效果。
3/储存事项:
① 在RNase A管和DNase I管分别加入1毫升的裂解缓冲液LS吹打，颠倒混匀，充分溶解RNase A和DNase I后， 按照每次使用量分装－20℃冻存，有效期6个月。
② 结合液LB低温时可能出现析出和沉淀，可以在37℃水浴几分钟帮助重新溶解，恢复澄清透明后冷却到室温即可使用。
③ 避免试剂长时间暴露于空气中产生挥发、氧化、pH值变化，各溶液使用后应及时盖紧盖子。
4/产品介绍：
λ噬菌体载体广泛用于文库筛选，目的克隆培养获得大量的噬菌体颗粒需要提取λ噬菌体DNA来开展测序等后续工作。λ噬菌体裂解培养物离心后的上清，首先用RNase A /DNase I混合酶消化去除残留的宿主菌DNA/RNA，沉淀收集噬菌体，噬菌体被SDS裂解，残留碎片通过沉淀离心去除掉。裂解物上清中的λ噬菌体DNA在高离序盐状态下选择性吸附于离心柱内硅基质膜，再通过一系列快速的漂洗－离心的步骤，将盐、细胞代谢物、蛋白等杂质去除，最后低盐的洗脱缓冲液将λ噬菌体DNA从硅基质膜上洗脱。
5/产品特点：
① 不需要使用有毒的苯酚等试剂，也不需要乙醇沉淀等步骤。
② 节省时间，简捷，可用于液体培养裂解物和固体培养板的提取，单个样品操作一般可在1.5小时内完成。
③ 产量高，典型的产量10ml λ噬菌体裂解培养物上清可以提取约10µg λ噬菌体DNA。
④ 多次柱漂洗确保高纯度，OD260/OD280典型的比值达1.7～1.9。可以直接用来酶切和测序。
6/注意事项
① 使用转速可以达到13,000rpm的冷冻离心机。
② 开始实验前将需要的水浴先预热到37℃备用。
③ 需要自备氯仿，20％SDS。
④ 结合液LB含有刺激性化合物，操作时要戴乳胶手套，避免沾染皮肤，眼睛和衣服。若沾染皮肤、眼睛时，要用大量清水或者生理盐水冲洗。
7/操作步骤：（实验前请先阅读注意事项）
以10 ml噬菌体感染细菌培养上清提取举例：
提示：
● 第一次使用前请先在漂洗液WB中加入指定量无水乙醇，充分混匀，加入后请及时在方框打钩标记已加入乙醇，以免多次加入!
● 将噬菌体沉淀液PB放在冰上预冷。
1、将0.5%氯仿处理后的λ噬菌体感染的液体培养物10,000g（约12,000rpm） 4℃离心10分钟去除细胞碎片和残渣。 转速不能过高，时间不能过长，否则噬菌体可能和碎片一起沉淀，降低产量。
2、取10ml上清，加入20μl RNase和20μl DNase充分混匀37℃温育30分钟。每个噬菌体培养上清因生长和裂解情况不同而残留RNA/DNA量不等。RNase/DNase消化过头，可能减少产量；消化不完全，可能未消化的DNA/RNA和细胞碎片粘去部分噬菌体减低产量并/或者导致最后污染宿主菌DNA，因此应该根据实际情况适当调节用量和消化时间。
3、加入2 ml 冰预冷的噬菌体沉淀液PB，轻柔充分混匀后置冰上冷却（培养板裂解物必须在冰上放置30分钟）。
4、10,000g（12,000rpm）4℃离心10分钟，弃上清，干燥1分钟。沉淀下来的噬菌体外观为透亮或者稍白的沉淀。
5、加入500μl裂解缓冲液LS，吹打重悬噬菌体，加入100μl 20％SDS，立即轻柔颠倒混匀4-6次后，70℃温育10分钟，然后置冰上冷却。
6、加入100μl杂质沉淀液IP，立即轻柔颠倒混匀4-6次，最高速13,000g 4℃离心10分钟。
7、仔细将上清转入新的离心管，加入350μl结合液LB，轻柔涡旋混匀。
8、将上述混合物加入一个吸附柱DA中，（吸附柱放入收集管CT中）12,000rpm离心30秒，倒掉收集管CT中的废液。吸附柱一次最多只可以容纳大约700μl混合物，因此需要分次把混合物移到吸附柱内，重复步骤8。
9、加入600μl漂洗液WB（请先检查是否已加入无水乙醇!），12,000rpm 离心30秒，弃废液。
10、可选步骤：重复步骤9一遍。
11、将吸附柱DA放回空收集管CT中，13,000rpm离心2分钟，尽量除去漂洗液， 以免漂洗液中残留乙醇抑制下游反应。
12、取出吸附柱DA，放入一个干净的离心管中，在吸附膜的中间部位加100μl洗脱缓冲液EB（洗脱缓冲液事先在 50℃水浴中预热）， 室温放置1分钟，12,000rpm 离心1分钟。如果想得到较多量的DNA，可将得到的溶液重新加入离心吸附柱中，12,000rpm离心1分钟。
洗脱体积越大，洗脱效率越高，如果需要DNA浓度较高，可以适当减少洗脱体积， 但是最小体积不应少于40μl，体积过小降低DNA洗脱效率，减少DNA产量。
13、DNA可以存放在2-8℃，如果要长时间存放，可以放置在-20℃。
8/问题与解决方法:
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问题
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评论与建议
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低核酸产量
或者纯度不高
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* 试剂盒储存在非最佳条件
-建议：收到试剂盒后总是存放在室温（15℃-20℃）。
* 缓冲液或者试剂暴露于减少它们有效性的条件下
-建议：储存在室温（15℃-20℃），每次用完后立刻盖紧盖子，以免溶液蒸发，pH改变和污染。
* 漂洗液WB中忘记加无水乙醇
-建议：第一次实验时，在漂洗液WB中加入指定量无水乙醇。
* 试剂和样品没有充分混匀
-建议：加入每个试剂后都要充分混匀。
* 噬菌体上清滴度太低
-建议：1.确认λ噬菌体已经完全裂解了宿主菌（加入0.5%的氯仿可以帮助完全裂解）；2.离心去除宿主菌碎片残渣时间不能超过10分钟，转速不超过10,000g，否则否则噬菌体也可能和碎片一起沉淀丢失；3.重新培养一次噬菌体感染细菌。
* DNase I/RNase消化不足或者过头
-建议：消化过头，可能减少产量并导致最后污染宿主菌DNA；消化不完全，可能未消化的DNA，RNA和细胞碎片粘去部分噬菌体，因此可以适当调节用量。
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宿主菌基因组
DNA残留过高
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* DNase I/RNase失活或者反应条件不佳
-建议：DNase I/RNase必须溶解在裂解缓冲液LS中，必须分装冻存。λ噬菌体必须用LM(含镁离子)培养，在其它培养肉汤中，DNase消化活性可能受到影响。
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加入噬菌体
沉淀剂后未见到
λ噬菌体沉淀
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* 不适合的离心温度和离心力。
-建议：10,000g（12,000rpm）4℃离心10分钟。
* 上清中含λ噬菌体太少
-建议：离心前，样品置冰上冷却。参见前面滴度太低解决办法
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DNA下游酶切不能切开或者酶切不完全
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*忘记做步骤11，乙醇抑制了酶切反应
-建议：做步骤10，然后空气中晾几分钟，让残留乙醇挥发。
*一些硅基质膜成分一起洗脱下来，抑制了酶切反应
-建议：将洗脱的基因组DNA溶液13,000rpm再离心一分钟，小心取上清使用。
*使用了错误的培养基培养λ噬菌体
-建议：λ噬菌体必须用LM(含镁离子)培养，在其它培养肉汤中，DNA酶切活性可能受到影响。培养板培养必须用琼脂糖Agarose板，如果用琼脂Agar板，可能抑制酶切。
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纯化的DNA
产物D260
数值异常偏高
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*一些硅基质膜成分一起洗脱下来，干扰了分光光度计读数
-建议：将洗脱的回收DNA溶液13,000rpm再离心一分钟，小心取上清使用。
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