1/适用范围：

适用于快速提取M13噬粒单链DNA。

2/试剂盒组成、储存、稳定性：

                                   本试剂盒在室温储存12个月不影响使用效果。

3/储存事项:

① 结合液MS低温时可能出现析出和沉淀，可以在37℃水浴几分钟帮助重新溶解，恢复澄清透明后冷却到室温即可使用。

② 避免试剂长时间暴露于空气中产生挥发、氧化、pH值变化，各溶液使用后应及时盖紧盖子。

4/产品介绍：

M13和其它的丝状噬菌体载体，在文库构建和为序列测序提供单链DNA和引人突变方面十分有用。将适量M13丝状噬菌体或者相关噬粒（M13来源）感染的液体培养物离心，上清中的单链噬菌体DNA在高离序盐状态下选择性吸附于离心柱内硅基质膜，再通过一系列快速的漂洗－离心的步骤，将盐、细胞代谢物，蛋白等杂质去除，最后低盐的洗脱缓冲液将纯净噬菌体单链DNA从硅基质膜上洗脱。

5/产品特点：

① 不需要使用有毒的苯酚等试剂，也不需要乙醇沉淀等步骤。

② 节省时间，简捷，单个样品操作一般可在10分钟内完成。

③ 产量高，典型的产量800µl M13丝状噬菌体上清可以提取3µg噬菌体单链DNA。

④ 多次柱漂洗确保高纯度，OD260/OD280典型的比值达1.7～1.9。可以直接用来测序，一般典型可辨认读长达650bp。

6/注意事项

① 所有的离心步骤均在室温完成，使用转速可以达到13,000rpm的传统台式离心机。

② 开始实验前将需要的水浴先预热到50℃备用。

③ 结合液MS含有刺激性化合物，操作时要戴乳胶手套，避免沾染皮肤，眼睛和衣服。若沾染皮肤、眼睛时，要用大量清水或者生理盐水冲洗。

7/操作步骤:（实验前请先阅读注意事项）

以800μl噬菌体感染细菌培养上清提取举例:

提示：第一次使用前请先在漂洗液WB中加入指定量无水乙醇，充分混匀，加入后请及时在方框打钩标记已加入乙醇，以免多次加入!

1、将M13丝状噬菌体或者相关噬粒（M13来源）感染的液体培养物分装在1.5毫升离心管，12,000rpm离心5分钟沉淀菌体。

2、小心取800μl上清转入新的1.5ml离心管，加入400μl结合液MS，充分混匀。

如果使用的上清大于或者小于800μl，则结合液MS的用量需要按照比例增加或者减少。

3、将上述混合物加入一个吸附柱DA中，（吸附柱放入收集管CT中）13,000rpm离心15秒，倒掉收集管CT中的废液。

吸附柱一次最多只可以容纳大约700μl混合物，因此需要分次把混合物加到吸附柱内，重复步骤3。

4、加入600μl漂洗液WB（请先检查是否已加入无水乙醇!），12,000rpm 离心30秒，弃废液。

5、将吸附柱DA放回空收集管CT中，13,000rpm离心2分钟，尽量除去漂洗液， 以免漂洗液中残留乙醇抑制下游反应。

6、取出吸附柱DA，放入一个干净的离心管中，在吸附膜的中间部位加60μl洗脱缓冲液EB（洗脱缓冲液事先在 50℃水浴中预热）， 室温放置1分钟，12,000rpm 离心1分钟。如果想得到较多量的DNA，可将得到的溶液重新加入离心吸附柱中，10,000rpm离心1分钟。

洗脱体积越大，洗脱效率越高，如果需要DNA浓度较高，可以适当减少洗脱体积， 但是最小体积不应少于40μl，体积过小降低DNA洗脱效率，减少DNA产量。

7、DNA可以存放在2-8℃，如果要长时间存放，可以放置在－20℃。

8/附录（M13噬菌体感染细菌培养上清准备过程）:

下面举例说明M13噬菌体感染细菌培养上清准备过程，详细的M13噬菌体（或M13来源噬粒）培养和上清准备过程请参见『分子克隆』第二版。

1、37℃ 振摇过夜培养合适的噬菌体宿主菌（如JM109）。

2、使用6％的过夜培养菌接种新鲜的LB培养液，37℃振摇培养一个小时。

3、根据M13噬菌体的储存液的浓度（滴度）按照0.5-1.5%(V/V)的比例加入噬菌体来感染宿主菌。37℃振摇培养5-6个小时。

4、将上面M13丝状噬菌体或者相关噬粒（M13来源）感染的液体培养物分装在1.5ml离心管，12,000rpm离心5分钟沉淀菌体。

5、可选步骤: 小心取1ml上清转入新的1.5ml离心管， 重复步骤4离心5分钟。这步有助于去除上清中残留的微量宿主菌RNA或者DNA。

6、小心取800μl上清转入新的1.5ml离心管。

7、现在可以按照操作步骤提取噬菌体单链DNA。、

9/问题与解决方法: